人肝臟UGT1A1基因的發(fā)育表達及表觀遺傳調控機制.pdf

1、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGTs），是一類重要的Ⅱ相代謝酶，可以催化很多種化合物（包括藥物及環(huán)境有毒物質）發(fā)生葡萄糖醛酸化結合反應。研究表明，約35％的藥物通過UGTs代謝。UGTs主要由UGT1A、UGT2A和UGT2B3個亞家族構成。UGT1A1是其中唯一參與膽紅素代謝的酶，此酶活性的完全或部分缺失導致膽紅素不能與葡萄糖醛酸結合形成結合膽紅素，使非結合膽紅素在體內堆積，導致

2、Crigler-Najjar綜合征（包括Ⅰ型、Ⅱ型）和Gilbert綜合征。
　　新生兒高膽紅素血癥即新生兒黃疸，是新生兒期最常見的癥狀，發(fā)病率約60-80％。研究顯示，新生兒黃疸原因除了與母乳喂養(yǎng)、低體重、脫水、早產及UGT1A1基因多態(tài)性等有關外，更主要的是與肝臟UGT1A1發(fā)育不完善、酶活性缺失有關。這提示進行UGT1A1發(fā)育調控的研究是控制新生兒血膽紅素在正常水平的關鍵環(huán)節(jié)。
　　研究證實組蛋白修飾激活性標志H3K4

3、me2促進基因活化，而抑制性標志H3K27me3則沉默基因表達。Li等報道H3K4me2和H3K27me3共同參與了胎鼠及成年鼠Cyp3a基因的發(fā)育表達調控。但就肝臟UGT1A1的發(fā)育表達調控而言，有關表觀遺傳修飾機制方面的研究目前還未見報道。
　　綜上所述，表觀遺傳修飾參與UGT1A1表達調控的機制研究尚處于起步階段，本研究將探討人肝臟發(fā)育過程中UGT1A1的動態(tài)變化以及組蛋白修飾參與UGT1A1基因發(fā)育調控的機制。表觀遺傳調控

4、是引起藥物代謝及轉運個體差異的重要原因，藥物代謝酶的表觀修飾調控機制的深入研究，有助于臨床藥物的合理應用及不良反應的減少，為兒童患者發(fā)展個體化治療策略提供新的理論依據。本文主要從以下幾個方面進行論述:
　　第一部分:轉錄因子參與調控人肝臟發(fā)育過程中UGT1A1的動態(tài)表達
　　目的:
　　UGT1A1是肝臟中參與膽紅素葡萄糖醛酸化反應唯一的Ⅱ相酶，此酶活性的完全或部分缺失可以導致非結合型高膽紅素血癥。本部分研究UGT1A

5、1及相關轉錄因子在人肝臟發(fā)育過程中的動態(tài)表達，并分析它們之間是否存在相關性，探討轉錄因子發(fā)育表達對UGT1A1的動態(tài)表達的影響。
　　方法:
　　1.收集90例中國漢族人群肝臟標本，其中成人肝臟樣本41例（34-72歲），兒童肝臟樣本8例（3個月-2歲）和胎兒期肝臟樣本41例（18-38孕周）。
　　2.采用qRT-PCR方法檢測肝臟標本中UGT1A1及PXR、CAR、HNF1A、HNF4A和PPARA等轉錄因子的mR

6、NA表達情況，分析UGT1A1表達水平與轉錄因子表達水平之間的相關性。
　　3.采用western blot法及HPLC法檢測肝臟標本中UGT1A1的蛋白表達水平及體外酶活性。
　　4.采用直接測序法檢測UGT1A1*6（211G[]A）及UGT1A1*28（TA6[] TA7）遺傳多態(tài)性。
　　結果:
　　1.人肝臟發(fā)育過程中UGT1A1 mRNA、蛋白水平及酶活性的動態(tài)表達。UGT1A1表達在胎兒期很低，在兒

7、童期和成人期顯著增高。與胎兒期相比，兒童期和成人期UGT1A1的mRNA、蛋白及酶活性分別增高了120倍、20倍和10倍。
　　2.人肝臟發(fā)育過程中轉錄因子的表達水平及其與UGT1A1的相關性。轉錄因子PXR、CAR、HNF1A、HNF4A和PPARA等表達水平在人肝臟的各發(fā)育階段與UGT1A1表達水平一致，呈現動態(tài)表達。與胎兒組相比，兒童組和成人組轉錄因子表達水平顯著增高。轉錄因子PXR、CAR、HNF1A、HNF4A及PPAR

8、A等表達水平與UGT1A1的mRNA及蛋白表達水平均呈正性相關。
　　3.基因多態(tài)性對UGT1A1表達的影響。UGT1A1*6和UGT1A1*28使UGT1A1的mRNA、蛋白表達水平及酶活性降低了約40-60％。
　　結論:
　　1.在人肝臟的發(fā)育過程中，轉錄因子參與了UGT1A1基因的發(fā)育調控。
　　2.UGT1A1*6和UGT1A1*28顯著降低了UGT1A1的表達水平及酶活性。
　　第二部分:組蛋白

9、修飾參與調控人肝臟發(fā)育過程中UGT1A1的動態(tài)表達
　　目的:
　　組蛋白甲基化修飾是一種重要的表觀遺傳修飾，組蛋白修飾激活性標志物H3K4me2促進所在基因的活化，而抑制性標志物H3K27me3則抑制基因的表達。研究在人肝臟發(fā)育過程中胎兒期及成人期UGT1A1基因中組蛋白修飾富集峰的差異，初步探討組蛋白修飾對UGT1A1的動態(tài)表達的影響。
　　方法:
　　1.隨機選取4例肝臟樣本（包含胎兒期及成人期各2例），選

10、用特異性抗體H3K4me2和H3K27m3，進行染色質免疫共沉淀(CHIP)實驗。
　　2.將得到的富集DNA送深圳華大公司進行文庫構建、高通量測序，并進行生物信息學分析。
　　3.進行胎兒和成人肝臟H3K4me2及H3K27m3組蛋白修飾的全基因組圖譜分析。
　　4.隨機選取3例胎兒肝臟樣本和3例成人肝臟樣本，用設計的引物分別進行CHIP-qPCR檢測，驗證CHIP-seq實驗結果。
　　結果:
　　1.

11、H3K4me2在胎兒及成人肝臟富集峰差異分布。H3K4me2在成人肝臟UGT1A1基因的啟動子區(qū)附近有一個長度為5873 bp的富集峰;H3K4me2在轉錄因子HNF1A、HNF4A、GR、PXR、PPARA、CAR和RXRA等基因有一個或多個富集峰。
　　2.H3K27me3在胎兒及成人肝臟富集峰差異分布。H3K27me3在胎兒肝臟UGT1A1基因的啟動子區(qū)上游12 kb附近有一個長度為226 bp的富集峰;H3K27me3在轉

12、錄因子GR、CAR、RXRA、HNF4A等基因有一個或多個富集峰。
　　3.CHIP-qPCR驗證ChIP-seq結果的可靠性。與胎兒肝臟相比，H3K4me2在成人肝臟的平均富集倍數是3.2;而與成人相比，H3K27me3在胎兒肝臟的平均富集倍數是3.7，可見CHIP-qPCR結果與CHIP-seq結果一致，證實了CHIP-seq實驗結果的可靠性。
　　結論:
　　組蛋白修飾H3K4me2與H3K27me3參與調控了肝

13、臟發(fā)育過程中UGT1A1的動態(tài)表達。
　　第三部分:組蛋白修飾調控人肝臟發(fā)育過程中UGT1A1動態(tài)表達的分子機制
　　目的:
　　第二部分研究發(fā)現組蛋白修飾H3K4me2及H3K27me3參與了肝臟UGT1A1動態(tài)發(fā)育的表達調控，但組蛋白修飾參與UGT1A1基因的發(fā)育調控的分子機制不清，該部分擬用siRNA、CHIP-seq及Co-IP等方法探討轉錄因子是否募集組蛋白修飾酶等調控UGT1A1的基因表達。
　　方法

14、:
　　1.借助轉染siRNA下調HNF1A表達，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h-48 h，收集細胞進行qRT-PCR、Co-IP或CHIP分析。
　　2.選用特異性抗體將轉染siRNA48 h后收集的細胞，使用特異性H3K4me2、H3 Acetylation、HNF1A及NCOA6抗體，進行染色質免疫共沉淀處理，收集富集的DNA片段，進行qRT-PCR分析，探討轉染siRNA下調HNF1A表達前后在UGT1A1基因組蛋白修飾

15、H3K4me2及H3 Acetylation、核受體輔調節(jié)因子NCOA6及轉錄因子HNF1A的變化。
　　3.將轉染siRNA48 h后收集的細胞進行Co-IP檢測，探討轉錄因子HNF1A與組蛋白甲基化酶MLL1、以及HNF1A與核受體輔調節(jié)因子NCOA6是否存在相互作用。
　　4.檢測組蛋白甲基轉移酶EZH2表達水平及UGT1A1表達水平，并進行二者相關性分析。
　　結果:
　　1.siRNA干擾后檢測轉染細胞

16、內HNF1A及UGT1A1基因的表達。在HepG2及LS174T兩個細胞系中，轉染siHNF1A組與陰性對照相比，HNF1A及UGT1A1蛋白表達水平下降了約70-80％。
　　2.siHNF1A干擾對UGT1A1基因啟動子區(qū)組蛋白修飾的影響。在HepG2及LS174T兩種細胞系中，siHNF1A組與陰性對照組相比，在UGT1A1基因啟動子區(qū)的HNF1A結合位點附近(-181～-1)的H3K4me2及H3 Acetylation、

17、轉錄因子HNF1A及核受體輔調節(jié)因子NCOA6的富集均明顯下降。
　　3.Co-IP實驗證實，在LS174T細胞及HepG2細胞中，MLL1與HNF1A存在相互作用;NCOA6與HNF1A存在相互作用。
　　4.組蛋白甲基轉移酶EZH2與UGT1A1表達水平的相關性分析。EZH2蛋白在胎兒組呈現高表達，而在成人組呈低表達，而UGT1A1在胎兒組呈現低表達，而在成人組呈高表達。EZH2蛋白表達水平與UGT1A1 mRNA及蛋白