魚腥草揮發(fā)油抗肺癌藥效學及其羥丙基-β環(huán)糊精包合物的制備研究.pdf

1、目前，肺癌是全世界增長最快、發(fā)病率和死亡率最高的癌癥，是對人類生命和健康威脅最大的惡性腫瘤。天然抗腫瘤藥物的開發(fā)，特別是對來自于高等植物中的抗癌活性成分的研究，已成為抗癌藥物研究的熱點[1]。魚腥草（Houttuyniae Herba，HH）來源于三白草科蕺菜屬植物蕺菜，具有良好的清熱解毒，排膿消癰的功效[2]。魚腥草揮發(fā)油（Volatile oil from Houttuyniae Herba，HHO）是HH的主要活性部位，前期預實驗

2、表明，HHO能夠顯著抑制A549人肺癌細胞的生長增殖，基于此，本實驗以HHO作為研究對象，對其在體內外抗肺癌作用、羥丙基-β環(huán)糊精包合物的制備、體內藥代動力學及組織分布進行研究，為HHO作為抗肺癌新藥的研發(fā)及臨床應用提供可靠的科學依據(jù)。
　　1. HHO誘導A549人肺癌細胞凋亡初步研究
　　通過MTT法測定HHO作用后細胞生長抑制率，PI單染法檢測HHO作用后細胞周期變化，F(xiàn)ITC-Annerxin V/PI雙染法檢測HH

3、O作用后細胞凋亡率，光學顯微鏡觀察HHO作用后細胞形態(tài)學變化。
　　MTT法結果表明，HHO對A549肺癌細胞有明顯的抑制作用且有時間和濃度依賴性。不同終濃度HHO（0.25、0.3125、0.375、0.4375、0.5μL/mL）作用于A549肺癌細胞，24h抑制率最高達73.01％，IC50為0.3987μL/mL；48h抑制率最高達84.99%，IC50為0.3498μL/mL；72h抑制率最高達94.01%，IC50為0

4、.2729μL/mL，各組間具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。細胞周期結果顯示，隨著藥物濃度增加，G1期細胞比例逐漸減少，G2期和S期細胞比例逐漸增加，且組間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。細胞凋亡檢測結果顯示，濃度分別為0.05μL/mL、0.10μL/mL、0.15μL/mL、0.20μL/mL、0.25μL/mL、0.30μL/mL、0.35μL/mL的HHO誘導 A549細胞，48h后細胞凋亡率分別為12.63±1.27%、1

5、7.23±1.44%、48.50±2.71%、84.97±2.64%、76.15±2.38%、52.66±2.04%、49.59±1.45%，而壞死率分別為2.74±0.58%、2.52±1.08%、6.04±0.78%、2.79±1.57%、19.62±2.11%、40.16±2.89%、41.24±1.68%。不同HHO作用于A549細胞48h后，光學顯微鏡下觀察可見細胞膜皺縮，有泡狀突起，體積縮小，變圓，細胞數(shù)量減少。以上結果表明

6、，HHO能夠誘導 A549細胞程序性死亡，并且將A549細胞阻滯于G2期和S期，且S期居多，提示HHO誘導A549細胞凋亡的機制可能與阻礙G2期的RNA和蛋白質及S期的DNA的合成有關。
　　2. HHO羥丙基-β環(huán)糊精(hydrox-ypropyl-cyclodextrin，HPCD)包合物的制備
　　采用水溶液攪拌法制備HHO的HPCD包合物，以包合率及載藥量為評價指標，最終優(yōu)化制劑處方為：HHO：HPCD1：25（mL

7、/g），HPCD：水1：2（g/mL），包合溫度50℃，攪拌速度420r/min，包合時間80min。最終制得的包合物包合率達到77.35%，載藥量為4.48%，顏色均勻，粉末疏松，復水性好，穩(wěn)定性高。
　　TLC、GC、IR及差示掃描量熱法(DSC)均能很好證明包合物的形成，其中TLC、GC證明HHO被包合前后其化學成分并未發(fā)生改變，IR及DSC表明HHO被HPCD包合后并不是簡單的鍵和和混合，而是生成了新的物質，改變了HHO與

8、HPCD的原有物相。
　　3. HHO與HHO-HPCD包合物體內藥代動力學及HHO組織分布研究
　　采用GC法檢測HHO在體內的血藥濃度，繪制藥-時曲線，小動物活體成像法檢測HHO在體內的組織分布。HHO以240mg/kg灌胃、160mg/kg尾靜脈注射給藥，HHO-HPCD包合物以相當于同等HHO劑量給藥，結果顯示，HHO灌胃給藥后5min在血漿中即可檢測到甲基正壬酮，1h左右達到吸收峰值5.0438μg/mL，HHO靜

9、脈注射后迅速進入血液中，吸收峰值4.2947μg/mL。而HHO-HPCD灌胃給藥后5min在血漿中可以檢測到甲基正壬酮，30min左右達到吸收峰值4.6508μg/mL，HHO-HPCD包合物靜脈注射后迅速于血液中，吸收峰值3.4805μg/mL。表明HHO在血液中迅速吸收并達到血藥濃度峰值。觀察到HHO-HPCD灌胃后血藥濃度達峰時間明顯短于 HHO，且體內滯留時間也短于HHO，說明HPCD包合HHO具有使HHO加速釋放的作用。

10、r>　　活體成像結果顯示，HHO灌胃后能快速吸收至全身，4h后達到吸收峰值，且在肝腎處富集較多，HHO尾靜脈注射后迅速吸收入血并分布于全身，5min后便有藥物在氣管處富集，1h后有藥物在肺部富集，有少量藥物富集于膀胱，2~4h有藥物在肝腎處富集并最終排泄。組織成像結果顯示，HHO灌胃12h后，藥物主要富集在肝、腎、肺及氣管處，HHO尾靜脈注射12h后，藥物在小鼠心、肝、脾、肺、腎及氣管處均有富集，表明HHO經肝、腎排泄且具有一定的肺部靶

11、向性。
　　4. HHO體內抗肺癌藥效學研究
　　構建 lewis肺癌荷瘤腫瘤模型，隨機分為5組：陰性對照組、HHO80mg/kg組、HHO160mg/kg組、HHO240mg/kg組及順鉑1mg/kg組。治療期間觀察小鼠生活狀態(tài)，繪制荷瘤小鼠生存曲線。測量瘤重并計算抑瘤率。治療結束后將腫瘤組織進行HE染色觀察細胞形態(tài)學變化。
　　結果顯示，HHO80mg/kg組、HHO160mg/kg組、HHO240mg/kg組的抑

12、瘤率分別為36.96%、45.37%和52.65%，與陰性組相比，HHO對小鼠肺癌有明顯的抑制作用，并呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。腫瘤的HE染色切片表明，與順鉑組及陰性組腫瘤切片相比，HHO能夠顯著殺死癌細胞，使細胞間間隙增加且邊緣有纖維結締組織包繞，抑制肺癌的增長。各組荷瘤小鼠的內臟HE染色切片表明，魚腥草揮發(fā)油對肝臟有一定的毒性，使肝臟細胞間間隙增加且結締組織增加。低濃度HHO對小鼠心、脾、肺和腎毒性不明顯，但當濃度增加后，其對小鼠的脾