職業(yè)性噪聲聽力損失敏感人群全外顯子SNP特征分析及遺傳易感標(biāo)志的研究.pdf

1、噪聲性聽力損失(Noise-induced Hearing Loss，NIHL)是長期接觸有害噪聲引起的進(jìn)行性感音神經(jīng)性聽力損傷。NIHL是由環(huán)境因素和遺傳因素交互作用發(fā)生的。以往研究關(guān)注較長時間噪聲暴露的遺傳易感性，但我們先期的研究發(fā)現(xiàn)，新入職的青年工人，排除其他聽力損失的原因，在職業(yè)噪聲暴露三年內(nèi)存在聽力損失的風(fēng)險，為職業(yè)性噪聲暴露的敏感人群。本研究主要探討該NIHL敏感人群的遺傳易感性。首先采用全外顯子組測序法對5例短期內(nèi)接觸噪聲

2、發(fā)生NIHL的青年工人進(jìn)行外顯子測序，對比SNP（亞洲人群頻率篩選）數(shù)據(jù)庫，篩選候選的易感SNP位點;進(jìn)而對候選SNP位點與青年工人較短時間發(fā)生NIHL的相關(guān)性進(jìn)行驗證，并進(jìn)一步探討候選SNP位點與一般噪聲暴露人群NIHL的相關(guān)性;最后通過構(gòu)建NIHL動物模型，檢測候選SNP的基因在噪聲暴露后mRNA的相對表達(dá)水平，以確定靶基因是否在轉(zhuǎn)錄水平上對噪聲暴露進(jìn)行應(yīng)答，在機制上驗證易感性關(guān)聯(lián)的可能性。
　　1.噪聲敏感人群的全外顯子組測

3、序及候選SNP篩選
　　對5例噪聲暴露三年內(nèi)就發(fā)生NIHL的新人職青年工人進(jìn)行全外顯子組測序，測序過程包括DNA提取、DNA質(zhì)檢、文庫構(gòu)建、外顯子區(qū)域捕獲、高通量測序、生物信息學(xué)分析。通過比對SNP（亞洲人群頻率篩選）數(shù)據(jù)庫，根據(jù)SNP位點位于外顯子區(qū)域、突變?yōu)榉峭x突變、4個以上測序樣本都發(fā)生突變，而正常漢族人群中等位基因頻率突小于0.2等標(biāo)準(zhǔn)納入目的靶基因。一共篩選出27個SNP位點，其中5個測序樣本都突變的SNP位點有6個，

4、包括TTLL4 rs3731877、STK36rs1344642、BSPH1 rs60213124、HGC6.3 rs76543658、COL28A1 rs6952195、COL28A1 rs55745506。其中TTLL4基因編碼的蛋白是一種催化微管蛋白絡(luò)氨酸殘基磷酸化的蛋白，在細(xì)胞的生長、繁殖、分化過程中具有重要的作用;STK36基因編碼的蛋白屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族;STK36基因的缺陷可能導(dǎo)致運動纖毛功能性缺失;BSPH1基因

5、編碼粘附相關(guān)蛋白，參與機體能量代謝;基因庫中對于HGC6.3基因尚無明確定義;COL28A1基因編碼的蛋白質(zhì)屬于膠原蛋白家族，是一種生物性高分子化合物，在人體細(xì)胞中扮演結(jié)合組織的角色。
　　2.候選SNP與噪聲性聽力損失遺傳易感性的研究
　　2.1外顯子測序目的靶基因位點多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性分析
　　本研究著重對TTLL4 rs3731877、STK36 rs1344642、BSPH1 rs60213124等三個S

6、NP位點進(jìn)行驗證。采用1∶1配對病例對照方法，首先以19對接噪工齡小于3年的發(fā)生NIHL的工人和對照為研究對象，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)和直接測序法，分析候選SNP與NIHL易感性的相關(guān)關(guān)系;進(jìn)而以177對發(fā)生NIHL的工人和對照為研究對象，對目的靶基因的多態(tài)性與NIHL易感性進(jìn)行分析，并對靶基因多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性進(jìn)行了年齡、工齡分層分析。研究結(jié)果顯示在短期內(nèi)接觸噪聲發(fā)生NIHL的青年工人中，BSPH1rs60213124位點的G、A等位

7、基因頻率分布在組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（x2=6.33，P＜0.05）;顯性模型(AA/AG VS.GG)分析結(jié)果顯示攜帶AA/AG基因型的個體患NIHL的危險度是攜帶GG基因型個體的7.65倍(OR=7.65，95％CI=1.37-42.71)。未發(fā)現(xiàn)BSPH1rs60213124、TTLL4rs3731877、STK36rs1344642位點多態(tài)性與其他工齡和年齡組發(fā)生NIHL的相關(guān)性。研究結(jié)果提示，BSPH1 rs60213124位點可

8、能是短期內(nèi)接觸噪聲青年工人發(fā)生NIHL的易感基因位點，但結(jié)果需要加大樣本量進(jìn)一步研究。
　　2.2 GJB2、NCL、CDH23、PCDH15基因多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性分析
　　本研究旨在探討GJB2基因rs2274083、rs2284084、rs72474224、NCL基因rs7598759、CDH23基因rs10999947、PCDH15基因rs4935502、rs108252693等位點的多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性。研

9、究結(jié)果表明，GJB2基因rs2274084的基因型分布在兩組組間存在統(tǒng)計學(xué)差異（x2=8.51，P=0.014），等位基因分布在兩組間也存在統(tǒng)計學(xué)差異(x2=8.06，P=0.005)，攜帶CC基因型的個體患NIHL的危險度是攜帶TT基因型個體的2.17倍（OR=2.17，95％CI=1.04-4.53）。對該位點進(jìn)行工齡分層分析，在小于5年工齡組和大于15年工齡組，該位點基因型分布和等位基因頻率分布在病例組和對照組之間均存在統(tǒng)計學(xué)差異

10、，并且大于15年工齡組的攜帶CC基因型個體罹患NIHL的危險度要高于小于5年工齡組攜帶CC基因型的個體。CDH23rs10999947位點基因型分布在病例組和對照組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異（x2=8.82，P=0.01），攜帶GG基因型的個體患NIHL的危險度是AA基因型個體的4.03倍(OR=4.03，95％CI=1.44-11.3)。該位點隱形模型分析結(jié)果顯示，攜帶GG/AG基因型的個體患NIHL的危險度是AA基因型個體的4.14倍(OR

11、=4.14，95％CI=1.51-11.34)。對該SNP位點進(jìn)行人群年齡與工齡分層分析，結(jié)果顯示在年齡35-45歲段，該位點多態(tài)性與NIHL存在統(tǒng)計學(xué)相關(guān)（x2=6.3，P=0.04）。研究結(jié)果提示,GJB2基因rs2274084和CDH23基因rs10999947位點可能是NIHL的易感基因位點。
　　3.NIHL動物模型的構(gòu)建及耳蝸靶基因mRNA表達(dá)的檢測
　　采用白噪聲暴露小鼠的方式構(gòu)建NIHL的動物模型，對小鼠耳蝸

12、內(nèi)靶基因在噪聲暴露后mRNA相對表達(dá)進(jìn)行檢測，以判斷目的靶基因是否在轉(zhuǎn)錄水平上在參與了NIHL的發(fā)生過程。ABR檢測結(jié)果顯示，噪聲暴露后兩組小鼠聽閾值組間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，并且隨著電測聽頻率的升高，聽閾差值存在增大的趨勢?；啄や伷梢娫肼暯M小鼠耳蝸毛細(xì)胞出現(xiàn)缺損、倒伏嚴(yán)重。應(yīng)用熒光定量PCR對目的靶基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)GJB2基因、CDH23基因、PCDH15基因mRNA的相對表達(dá)量組間差異存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.0

13、5)。而對于其他靶基因，本研究未發(fā)現(xiàn)mRNA表達(dá)的差異。結(jié)果提示本研究構(gòu)建NIHL動物模型成功，GJB2基因、CDH23基因、PCDH15基因可能參與了NIHL的發(fā)生過程。
　　4.總結(jié)
　　經(jīng)外顯子測序和比對SNP（亞洲人群頻率篩選）數(shù)據(jù)庫，初步獲得6個可能的青年工人短期內(nèi)噪聲暴露發(fā)生NIHL的候選SNP位點，經(jīng)以接噪工齡小于3年發(fā)生NIHL的工人和對照為研究對象，分析候選SNP與NIHL易感性的相關(guān)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)BSPH1r

14、s60213124位點可能是短期內(nèi)接觸噪聲青年工人發(fā)生NIHL的易感基因位點。
　　對GJB2、NCL、CDH23、PCDH15基因多態(tài)性與NIHL的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)GJB2基因rs2274084和CDH23基因rs10999947位點與NIHL存在著相關(guān)性，GJB2基因rs2274084位點的CC基因型和CDH23基因rs10999947位點的GG基因型可能是噪聲性聽力損失的易感基因型。
　　采用白噪聲暴露小鼠的方式成功構(gòu)建