Fbln7基因敲除對小鼠心血管功能影響的初步分析.pdf

1、目的：
　　纖連蛋白7(Fibulin7，F(xiàn)bln7)是一種胞外基質(zhì)(ECM)蛋白，參與多種蛋白間的相互作用。Fbln7由于其在牙齒發(fā)育過程中與牙釉質(zhì)細(xì)胞的遷移和形成有關(guān)而被發(fā)現(xiàn)，但根據(jù)病例報道，很多2q13大片段缺失的先天性缺陷病人中大多數(shù)都表現(xiàn)出心臟的先天缺陷，這一類大片段缺失的關(guān)鍵區(qū)域已被縮小為長約474kb的小片段中，F(xiàn)bln7處在該關(guān)鍵區(qū)域所包含的六個基因中。Mark W.Russell等人在斑馬魚中的研究證明，使用mo

2、rpholino對斑馬魚胚胎敲低Fbln7表達(dá)會導(dǎo)致出生的斑馬魚存在明顯的心臟發(fā)育缺陷和顱面畸形。結(jié)合Fibulins家族各個基因在心血管發(fā)育中的作用，認(rèn)為Fbln7很可能在哺乳動物心臟發(fā)育過程中起到重要作用。因此本研究旨在通過crispr/cas9基因敲除技術(shù)在C57/B6的小鼠中研究Fbln7對于在小鼠心血管發(fā)育過程中的潛在功能及其作用機(jī)制。
　　方法：
　　由于Fbln7的相關(guān)研究較少，首先利用RT-PCR簡單分析了F

3、bln7基因在正常胚胎組織中的表達(dá)分布，通過檢測E14.5天胚胎的各個組織中Fbln7的表達(dá)情況。隨后通過構(gòu)建Fbln7基因系統(tǒng)敲除小鼠，對其進(jìn)行表型及功能分析。為了提高基因敲除效率，將所設(shè)計的分別針對Fbln7基因外顯子1(E1)與外顯子2(E2)的兩條gRNA混合注射入受精卵中并移植入假孕C57/B6雌鼠體內(nèi)。通過基因組測序的方法對子代小鼠敲除位點附近片段進(jìn)行驗證，并選擇雜合的雄性小鼠和雌性小鼠進(jìn)行繁殖交配。進(jìn)一步，利用wester

4、n blot檢測子代胚胎Fbln7蛋白表達(dá)變化情況。E14.5天胚胎通過卵黃膜基因組PCR進(jìn)行基因型鑒定驗證敲除效果，在得到陽性結(jié)果后，為驗證Fbln7是否會影響小鼠胚胎心臟及其他組織器官的發(fā)育狀況，對來自不同窩的3組E14.5天Fbln7-/-胚胎及Fbln7+/+同窩對照胚胎樣品進(jìn)行四腔面連續(xù)石蠟切片，并通過HE染色進(jìn)行基本的形態(tài)學(xué)分析隨后取Fbln7純合敲除的小鼠進(jìn)行胚胎的形態(tài)學(xué)分析。同時對不同基因型新生鼠的出生率及生存時間進(jìn)行了

5、監(jiān)測。在E14.5天小鼠形態(tài)正常情況下，對6組Fbln7+/+和Fbln7-/-基因型的小鼠在8個月時進(jìn)行心臟超聲的檢測，進(jìn)一步分析心功能的差異。取Fbln7+/+和Fbln7-/-成年小鼠心臟進(jìn)行形態(tài)觀察并通過HE染色觀察流出道的形態(tài)、主動脈血管壁狀態(tài)。同時通過超聲結(jié)果分析主動脈弓處血流情況。對E14.5天Fbln7-/-胚胎心臟cDNA樣品中Fbln1、Fbln2、Fbln4、Fbln5、Fbln6基因的表達(dá)水平變化進(jìn)行熒光定量PC

6、R檢測分析敲除小鼠與野生小鼠心臟中目的基因的表達(dá)差異。
　　結(jié)果：
　　研究結(jié)果表明，在選取脫靶率較低的gRNA構(gòu)建cas9系統(tǒng)后，得到的Fbln7純合敲除的陽性小鼠在蛋白和RNA水平都得到了敲除。但在Fbln7-/-小鼠的胚胎及成體中并未檢測到預(yù)期的異常表型，F(xiàn)bln7-/-基因型的遺傳模式符合孟德爾遺傳定律(Homo∶Hetero∶WT=1∶2∶1)，出生后小鼠的生存狀況、存活率及生存時間都與Fbln7+/+小鼠無明顯差

7、異(P＞0.05)，通過HE染色對Fbln7-/-胚胎及成體心臟樣品進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)形態(tài)分析，觀察到主動脈弓壁顯示輕微彈性纖維排列紊亂，但并沒有明顯的異常結(jié)構(gòu)。而根據(jù)以往的研究提示，在Fbln7-/-小鼠無缺陷的可能原因是Fbln蛋白家族中的其他成員對其可能存在補(bǔ)償作用，彌補(bǔ)了Fbln7-/-基因缺失所帶來的影響，但在熒光定量PCR未能檢測到Fbln家族其他基因在Fbln7缺失小鼠心臟表達(dá)的明顯變化。
　　結(jié)論：
　　盡管Fbl