基于TNF-α跨膜段的跨膜真核表達(dá)載體的構(gòu)建與初步鑒定.pdf

1、[目的]
　　 1.誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子，RT-PCR擴(kuò)增TNF-α全長片段。
　　 2.構(gòu)建帶腸激酶酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和帶有FactorXa酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α。
　　 3.將已構(gòu)建的pcDNA3.1-TM-enter

2、okinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞。
　　 4.驗(yàn)證融合蛋白表達(dá)情況。
　　 5.驗(yàn)證酶消化細(xì)胞的細(xì)胞液中是否存在TNF-α。
　　 [方法]
　　 1.用佛波酯和脂多糖誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞表達(dá)mTNF-α，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增TM-TNF-αcDNA。
　　 2.分別構(gòu)建TM-TNF-α全長序列的克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-TNF-

3、α、帶腸激酶酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-enterokinase、帶有FactorXa酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-FactorXa。通過重疊PCR將已替換了enterokinase酶切位點(diǎn)和FactorXa酶切位點(diǎn)的跨膜段與s-TNF-α DNA片段連接后，插入pcDNA3.1(+)質(zhì)粒以構(gòu)建pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3

4、.1-TM-FactorXa-TNF-α表達(dá)載體。
　　 3.將已構(gòu)建的pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞。
　　 4.通過RT-PCR鑒定mTNF-αmRNA的表達(dá)。
　　 5.Western blotting檢測細(xì)胞總蛋白中TNF-α和胞外消化液中TNF-α表達(dá)。
　　 [結(jié)果]
　　 1

5、.成功構(gòu)建了TM-TNF-α全長序列的克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-TNF-α。
　　 2.成功構(gòu)建了帶腸激酶酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質(zhì)pcDNA3.1-TM-enterokinase、帶有FactorXa酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-FactorXa、帶腸激酶酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和帶有F

6、actorXa酶切位點(diǎn)的TM-TNF-α跨膜區(qū)連接TNF-α克隆質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α。
　　 3.檢測了重組質(zhì)粒pcDNA3.1-TM-enterokinase-TNF-α和pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α在3T3細(xì)胞中表達(dá)情況，兩種質(zhì)粒均能表達(dá)融合蛋白。
　　 4.pcDNA3.1-TM-FactorXa-TNF-α質(zhì)粒表達(dá)了跨膜的融合蛋白。
　　 [結(jié)論