HIV-1膜融合抑制劑的原核表達(dá)、純化及真核載體的構(gòu)建和活性檢測(cè).pdf

1、人類(lèi)免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)是引起獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)的病原體。依據(jù)病毒外殼是否包裹有富含脂質(zhì)的膜，可將病毒分為無(wú)囊膜病毒和囊膜病毒兩類(lèi)，HIV屬于囊膜病毒。囊膜病毒只有在病毒囊膜和靶細(xì)胞膜融合之后才能將其遺傳物質(zhì)釋放注入靶細(xì)胞，達(dá)到侵染靶細(xì)胞的目的。膜融合主要是由囊膜上的融合蛋白介導(dǎo)完成的，根據(jù)蛋

2、白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，囊膜病毒的融合蛋白可分為兩類(lèi)：Ⅰ類(lèi)融合蛋白和Ⅱ類(lèi)融合蛋白。Ⅰ類(lèi)融合蛋白在跨膜亞單位上有兩段高度保守的七肽重復(fù)序列，一個(gè)靠近N端，稱(chēng)為HR1、HR-A或N-peptide；另一個(gè)靠近C端，稱(chēng)為HR2、HR-B或C-peptide。這兩段七肽重復(fù)序列與融合蛋白的構(gòu)象變化緊密相關(guān)，晶體結(jié)構(gòu)學(xué)研究表明這兩段七肽重復(fù)序列能夠形成發(fā)卡三聚體結(jié)構(gòu)(或稱(chēng)六螺旋束結(jié)構(gòu))，被認(rèn)為是Ⅰ類(lèi)融合蛋白膜融合后構(gòu)象的核心結(jié)構(gòu)。在發(fā)卡三聚體結(jié)構(gòu)中，三個(gè)螺

3、旋狀的C-peptides以反向平行的方式結(jié)合在由三個(gè)N-peptides所形成的中心三聚體結(jié)構(gòu)的周?chē)?，每一個(gè)C-peptide結(jié)合在由兩個(gè)N-peptides所形成的保守疏水溝槽中。經(jīng)證實(shí)C-peptides通過(guò)結(jié)合到N-peptide區(qū)以優(yōu)勢(shì)競(jìng)爭(zhēng)的方式抑制發(fā)卡三聚體的形成，從而阻斷膜融合；同樣N-peptides也可通過(guò)結(jié)合到C-peptide區(qū)從而阻斷膜融合。人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)的囊膜蛋白即為Ⅰ類(lèi)融合蛋白。 已

4、證實(shí)HIV-1的N肽(HR1)和C肽(HR2)都具有融合抑制活性。目前HIV-1的HR2多肽T-20已通過(guò)美國(guó)食品和藥物檢驗(yàn)局批準(zhǔn)，成為第一個(gè)抗艾滋病的膜融合抑制劑。還有許多基于HIV膜融合這一機(jī)制設(shè)計(jì)的類(lèi)似抑制劑也處于研究階段，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明C肽的穩(wěn)定性及膜融合抑制活性要優(yōu)于N肽，這可能是由于在缺乏C肽的情況下，N肽非常容易自身聚集，從而失去了與靶序列結(jié)合的能力。由于直接衍生于HR1的N肽水溶性差、容易聚集、難以發(fā)揮作用，因此C肽是

5、目前最有前景的抗HIV融合抑制劑。 本實(shí)驗(yàn)室前期工作者用HR1基因和HR2基因分別構(gòu)建了三種HIV-1膜融合抑制劑HR212(HR2-HR1-HR2)、HR121(HR1-HR2-HR1)和5-Helix(HR1-HR2-HR1-HR2-HR1)，并將其構(gòu)建在原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中。本實(shí)驗(yàn)對(duì)這三種蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)及純化，結(jié)果表明它們均可在大腸桿菌中可溶表達(dá)，用親和層析和凝膠過(guò)濾可得到高純度目的蛋白；體外膜融合抑制實(shí)驗(yàn)

6、證明它們均可抑制HIV-1假病毒發(fā)生膜融合，HR212、5-Helix和HR121蛋白的半數(shù)抑制濃度分別為2.8±0.63nM、13±3nM和16.2±2.8nM，其中HR212的膜融合抑制活性最高，因此與同類(lèi)抑制劑相比較，HR212理論上可以作為理想的新一代膜融合抑制劑對(duì)AIDS患者進(jìn)行治療。但是目前抗艾滋病的融合抑制劑多為多肽形式，由于多肽類(lèi)藥物本身存在的一些缺陷，如不能口服及制備工藝復(fù)雜、成本高等，人們希望找到與肽類(lèi)效果相當(dāng)而又克

7、服其缺陷的其他形式抗HIV藥物。所以在研究HR212蛋白形式的同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)又進(jìn)一步將HR212基因構(gòu)建在真核表達(dá)載體pcDNA3.0上，以期HR212可以在DNA水平上發(fā)揮膜融合抑制活性。本實(shí)驗(yàn)首先將HR212基因構(gòu)建在真核表達(dá)載體pcDNA3.0上得到重組載體pcDNA3.0-HR212-c-myc和pcDNA3.0-HR212，然后將重組載體pcDNA3.0-HR21.2-c-myc轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞HepG2，分別進(jìn)行weste

8、rn blotting分析和細(xì)胞分泌阻斷實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明HR212可在真核細(xì)胞HepG2中分泌表達(dá)；構(gòu)建沒(méi)有c-myc標(biāo)簽的pcDNA3.0-HR212重組載體，目的是檢測(cè)c-myc標(biāo)簽蛋白是否對(duì)目的蛋白HR212在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)、活性等產(chǎn)生影響，試驗(yàn)結(jié)果證明pcDNA3.0-HR212質(zhì)粒的融合抑制活性高于pcDNA3.0-HR212-c-myc，說(shuō)明c-myc標(biāo)簽蛋白對(duì)HR212活性有一定影響，但未完全抑制；細(xì)胞融合抑制