馬爾尼菲青霉Atf21和Phx1基因功能與角質酶基因原核表達研究.pdf

1、馬爾尼菲青霉真菌(PM)是青霉真菌屬中唯一的一種溫度依賴性的雙相型條件致病真菌，它是馬爾尼菲青霉真菌病(PSM)的病原菌，25℃時以菌絲相生長，在37℃體外培養(yǎng)或者感染人體后轉換為致病性酵母相生長;主要流行區(qū)域在東南亞地區(qū)，PM對免疫功能低下的患者感染性強，對感染者造成致命性的全身性感染。目前，馬爾尼菲青霉真菌雙相轉換和致病性的分子機制尚不清楚。細胞轉錄因子是細胞感受外界信號后調控基因表達的關鍵分子，許多轉錄因子在調控基因表達的同時其基

2、因自身的表達會受到調控。深入研究轉錄因子及其調控基因功能探討馬爾尼菲青霉雙相轉換與致病性分子機制，可為馬爾尼菲青霉病防治和藥物開發(fā)提供科學依據。
　　目的:
　　1、本課題組前期進行的馬爾尼菲青霉菌鏈特異性轉錄組的測序分析發(fā)現(xiàn)，編碼含亮氨酸拉鏈(bZIP)的轉錄因子基因Atf21和編碼含有同源異型盒(homeobox)結構域的轉錄因子基因Phx1在雙相轉換過程中差異表達顯著，本課題通過構建馬爾尼菲青霉菌Atf21和Phx1基

3、因缺失突變體，對轉錄因子基因Atf21和Phx1的功能進行了初步研究，探討馬爾尼菲青霉雙相轉換與致病性分子機制，可為馬爾尼菲青霉病防治和藥物開發(fā)提供科學依據。
　　2、本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)編碼角質酶轉錄因子β亞基基因（Ctf1β）及其調控的角質酶基因在酵母相表達顯著升高。本課題擬通過克隆馬爾尼菲青霉菌角質酶的基因，構建角質酶原核表達重組菌，進行角質酶的活性鑒定與分析，獲得重組蛋白為進一步制備馬爾尼菲青霉菌角質酶抗體和探討該抗體在防

4、治馬爾尼菲青霉病中的應用奠定基礎。
　　方法::
　　1、用實時熒光定量方法分析馬爾尼菲青霉菌株GXFF在雙相轉換過程中基因表達量和基因表達特征。
　　2、利用同源重組方法，構建目的基因敲除突變株，然后與Spm4野生菌株進行對比研究，初步研究和分析突變缺失基因的功能。
　　3、通過引物設計、PCR擴增馬爾尼菲青霉菌角質酶基因序列，構建誘導型表達載體，并對重組質粒進行PCR鑒定和質粒的測序;用堿式滴定法測定酶活性;

5、提取蛋白對角質酶進行表達鑒定。
　　結果:
　　1、Atf21和Phx1基因在馬爾尼菲青霉菌雙相轉換不同時相的表達進行分析結果表明，在馬爾尼菲青霉菌株GXFF中Atf21和Phx1基因表達在菌絲相生長狀態(tài)顯著高于在酵母相生長狀態(tài)，與在馬爾尼菲青霉菌株FRR2161中轉錄組測序分析Atf21基因表達結果一致;Atf21在雙相轉換早期基因表達明顯改變，在雙向轉化過程中Phx1基因表達出現(xiàn)明顯改變時間較晚。
　　2、成功構建

6、了Atf21和Phx1基因敲除菌株，與對照菌Spm4對比，Atf21突變菌株對Cu更加敏感，Phx1突變菌株對Cu的敏感性無影響。
　　3、成功克隆了馬爾尼菲青霉菌角質酶基因，構建了誘導型表達載體并進行測序驗證;構建了馬爾尼菲青霉菌角質酶基因大腸桿菌原核表達重組菌株;用堿式滴定法測定重組菌株酶活性約為對照菌1.7倍，粗酶液的酶活性可達21.8U/mL。
　　結論:
　　1、馬爾尼菲青霉菌Atf21和Phx1基因在雙相轉

7、換不同時相表達差異顯著，Atf21和Phx1基因表達在菌絲相生長狀態(tài)顯著高于在酵母相生長狀態(tài);Atf21在雙相轉換早期基因表達明顯改變，在雙向轉化過程中Phx1基因表達出現(xiàn)明顯改變時間較晚。
　　2、成功構建了Atf21和Phx1基因敲除菌株，創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌轉錄因子基因Atf21具有調控銅離子代謝功能，為深入探討馬爾尼菲青霉雙相轉換與致病性分子機制奠定了基礎。
　　3、成功克隆了馬爾尼菲青霉菌角質酶基因，構建了馬