IL3-LDM靶向融合蛋白對人急性髓系白血病NOD-SCID小鼠模型的治療作用研究CD26慢病毒表達載體的構建及穩(wěn)定轉染細胞系的建立.pdf

1、本文主要從以下幾部分進行討論：
　　第一部分 IL3-LDM靶向融合蛋白對人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的治療作用研究
　　目的:利用分離的人外周血單個核細胞建立急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型，觀察小鼠的一般情況、應用流式細胞術檢測外周血CD45細胞陽性率，病理學檢查鑒定動物模型;利用該模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白對白血病小鼠的治療作用。
　　方法:1.人外周血單個核細胞的分離和培養(yǎng)，流式細胞儀

2、檢測其免疫表型，進行AML干細胞特性的鑒定;
　　2.人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型的建立:將NOD/SCID小鼠隨機分為模型組和對照組，兩組小鼠經全身X線照射300cGay，6-12個小時內通過尾靜脈注射AML病人樣本中CD123陽性率最高的人外周血單個核細胞(用臺盼藍拒染法，細胞活性95％，1×107個/只，液體總量0.2 ml)到模型組小鼠，對照組小鼠通過尾靜脈注射等體積PBS作為正常對照;
　　3.急性髓系

3、白血病NOD/SCID小鼠模型的鑒定:觀察小鼠的一般情況;流式細胞術檢測小鼠外周血CD45細胞陽性率;移植60天后處死小鼠，采用組織病理檢查，檢測小鼠肝臟、脾臟、肺臟等的白血病特征。
　　4.利用上述建立的模型研究IL3-LDM靶向融合蛋白對白血病小鼠的治療作用，設置多個治療組，并進行療效評價。
　　結果:1.分離并培養(yǎng)人外周血單個核細胞，經抗人CD34-PE、CD38-FITC、CD123-PerCPcy5.5抗體標記后，

4、流式細胞術檢測結果顯示有CD34+CD38-細胞群，而且CD123+細胞占AML干細胞的比例均為90％以上。
　　2.成功建立人急性髓系白血病NOD/SCID小鼠模型:移植后的模型組小鼠均發(fā)生典型白血病表現，而對照組小鼠無;模型組小鼠的尾血中檢測CD45+細胞，而對照組小鼠無;模型組NOD/SCID小鼠的肝、脾、肺等均有腫瘤細胞浸潤，細胞呈團塊狀生長，包繞器官或者浸潤器官內部，受浸潤組織結構破壞，而對照組小鼠的相應組織未發(fā)現明顯腫

5、瘤細胞浸潤。
　　3.體內實驗證明，經IL3-LDM靶向融合蛋白治療后，白血病模型小鼠組一般情況明顯好于模型組（PBS對照組），其外周血的白血病細胞含量明顯下降，其肺、腎、脾等臟器的炎癥及病理變化減輕。
　　結論:采用NOD/SCID小鼠在給予全身照射的移植前預處理基礎上成功建立了人急性髓系白血病的動物模型，為研究AML的可能發(fā)病機制奠定了基礎。體內實驗進一步證實，IL3-LDM靶向融合蛋白對白血病細胞有一定的殺傷抑制作用，

6、IL3-LDM融合蛋白也為臨床治療AML提供了新思路。
　　第二部分 CD26慢病毒表達載體的構建及穩(wěn)定轉染細胞系的建立
　　CD26作為一種具有多種生物學功能的蛋白酶類，在炎性反應、組織修復、細胞移行、腫瘤侵襲、免疫調節(jié)、信號轉導及細胞、凋亡等生理及病理過程中均起到重要作用。在臨床中與多種腫瘤疾病存在相關性，可以作為腫瘤的預測因子或生物標志物。針對CD26的深入研究，對于揭示相關腫瘤疾病的發(fā)病機制，促進臨床診斷、鑒別分析，

7、分子靶向治療的開展和判定療效及預后等，均不失有潛在的重要意義，CD26也有望成為未來疾病治療的新靶點。
　　目的:構建人CD26慢病毒表達載體，轉染NIH/3T3細胞，建立穩(wěn)定轉染的NIH/3T3細胞株。
　　方法:抽提含pCDH1-MCS1-EF1-copGFP慢病毒載體的質粒和pEZ-Lv105-CD26質粒。利用XBaⅠ和BamHⅠ進行雙酶切，用T4連接酶將膠回收的CD26目的片段克隆至載體pCDH1-MCS1-EF1

8、-copGFP，構建形成pCDH-CD26質粒。轉化DH5à感受態(tài)細胞，菌落PCR初步篩選出陽性克隆，并進行酶切鑒定和送測序分析。利用三質粒慢病毒系統(tǒng)轉染293T細胞，生產慢病毒并檢測獲得的病毒滴度。利用所獲得的慢病毒感染NIH/3T3細胞，通過FACS AriaⅢ(BD公司)流式細胞儀分選出表達CD26的陽性細胞，并進一步用FACS做分析鑒定，獲得穩(wěn)定轉染NIH/3T3細胞株。
　　結果:成功構建pCDH-CD26慢病毒表達載體