表達人CD4分子的小鼠白血病細胞系的建立及其細胞周期研究.pdf

1、近年來分子生物學發(fā)展迅速，基因轉染已經(jīng)廣泛用于多種實驗方法和治療方法中。為了讓小鼠白血病細胞表達特定抗原分子作為腫瘤特異性抗原(TSA)，我們選用逆轉錄病毒載體將目的基因轉入靶細胞。本項實驗工作，共分為兩部分。 實驗一表達人CD4基因的逆轉錄病毒載體的構建 目的：構建高效穩(wěn)定表達人CD4(hCD4)基因的逆轉錄病毒載體，使hCD4分子能穩(wěn)定持久表達于靶細胞。 方法：利用PCR技術大量擴增hCD4cDNA的目的基因

2、，并引入酶切位點中，用連接酶將目的基因與載體pLXIN相連接，隨后轉入感受態(tài)大腸桿菌進行擴增，PCR鑒定出正確轉染的陽性菌落，經(jīng)酶切及測序證實hCD4目的基因已經(jīng)成功轉入載體(稱為pLXIN-hCD4質粒)后，再用脂質體法將質粒pLXIN-hCD4轉染到PT67包裝細胞，經(jīng)藥物篩選出抗性克隆并擴增建系，收集含病毒顆粒的上清液以感染靶細胞。 結果：PCR菌落鑒定及酶切鑒定顯示hCD4基因成功地插入pLXIN載體中，經(jīng)測序與gene

3、bank中的序列完全一致。質粒pLXIN-hCD4轉染成功的PT67細胞可以抵抗G418生長，將抗性細胞克隆挑出培養(yǎng)，得到穩(wěn)定產(chǎn)生病毒顆粒的PT67細胞(為hCD4-PT67細胞)。 結論：本實驗成功構建了能表達hCD4基因的重組質粒pLXIN-hCD4。 實驗二表達人CD4分子的L615細胞的獲得及其細胞周期研究 目的：研究hCD4-PT67細胞產(chǎn)生的病毒顆粒感染小鼠T淋巴細胞白血病細胞系L615后(感染后稱為

4、L615-hCD4細胞)，L615-hCD4細胞表達hCD4分子的情況，以及該細胞的細胞周期。 方法：收集hCD4-PT67細胞含病毒顆粒的上清液感染L615細胞，用G418篩選出感染成功的細胞，擴增后利用流式細胞儀檢測L615-hCD4細胞表達hCD4分子的情況。并用PI-FCM法檢測L615細胞和L615-hCD4細胞的細胞周期。 結果：感染所獲得的L615-hCD4細胞高度表達hCD4分子，反復傳代后hCD4分子仍