Fibrinogen與足細胞損傷及腎臟疾病進展的研究.pdf

1、目的：
　　已有研究報道TLR4表達在免疫細胞、炎癥細胞和足細胞。Fibrinogen可以通過Toll-like receptor4(TLR4)參與血管壁疾病、類風濕性關節(jié)炎等多種疾病的炎癥。Fibrinogen激活巨噬細胞分泌白細胞介素6、白細胞介素8、腫瘤壞死因子、單核細胞趨化蛋白1。
　　足細胞損傷是形成蛋白尿的一個重要原因，可導致腎小球硬化癥。有報道體外實驗中fibrinogen通過TLR4刺激足細胞分泌趨化因子和細

2、胞因子。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)尿液fibrinogen水平在局灶節(jié)段腎小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis，F(xiàn)SGS)患者中是顯著升高的。
　　Fibrinogen是否可以通過TLR4信號通路導致足細胞破壞尚未可知。因此，本研究的目的:(1)探索fibrinogen是否導致足細胞細胞骨架破壞和凋亡增加？(2)Fibrinogen是否通過TLR4-p38MAPK-NFκB P65信號通路介導上述

3、效應？(3)Fibrinogen是否參與FSGS中足細胞的損傷？
　　材料與方法：
　　(1)在體外培養(yǎng)的人足細胞中加入fibrinogen（分別為20μg/ml，200μg/ml，800μg/ml三個劑量），對照組加入等量PBS;分別孵育12h和24h。利用流式細胞術檢測凋亡率情況和免疫熒光檢測細胞骨架F-actin。
　　在體外siRNA轉染實驗中，先分別利用controlsiRNA、TLR4siRNA轉染足細胞1

4、2h，再加入fibrinogen（800μg/ml）孵育24h。然后通過qRT-PCR檢測TLR4mRNA水平，觀察阻斷效果。利用流式細胞術檢測足細胞凋亡率，免疫熒光檢測F-actin。同時Western Blot檢測足細胞TLR4、總NFκB p65、磷酸化NFκBp65、總p38MAPK和磷酸化p38MAPK的水平。
　　(2)在阿霉素小鼠FSGS模型中，分別于第1周、2周、4周、6周收集尿和腎臟。檢測尿ACR(the rat

5、io of albumin to creatinine);利用ELISA法檢測尿上清液fibrinogen的水平。對尿液fibrinogen與尿ACR、足突融合進行相關性分析。對小鼠腎臟進行病理檢查(PAS染色、光鏡、電鏡);免疫熒光雙重染色分別檢測podocin與TLR4，fibrinogen與TLR4的共定位表達水平。
　　統(tǒng)計學方法:
　　所有的細胞實驗重復三次以上。連續(xù)變量數(shù)值以均數(shù)±標準差(SD)或中位數(shù)（四分位間

6、距，第25和第75百分位數(shù)）表示。GraphPad Prism5軟件(La Jolla，CA)進行統(tǒng)計分析，雙側t檢驗、非參數(shù)檢驗用來分析任意兩組間的差異。變量之間的相關性使用Spearman's相關分析方法進行。P＜0.05認為有統(tǒng)計學差異，P＜0.01認為差異更顯著。
　　結果：
　　(1)200μg/ml，800μg/ml fibrinogen干預可引起足細胞細胞骨架F-actin的明顯破壞和凋亡率顯著增高，與未處理組

7、比較該差異有統(tǒng)計學意義。
　　(2)在轉染實驗中，與control siRNA+fibrinogen組比較，TLR4siRNA+fibrinogen(800μg/ml)組中足細胞的凋亡率顯著降低，F(xiàn)-actin的破壞亦明顯減輕。TLR4mRNA表達下調(diào)和蛋白表達減少;磷酸化NFκB p65和磷酸化p38MAPK的水平降低，F(xiàn)ibrinogen介導的TLR4信號通路下游分子NFκB p65和p38MAPK的活化被抑制。
　　(

8、3)阿霉素小鼠FSGS模型的尿液ACR和fibrinogen水平顯著高于生理鹽水處理小鼠組，并且尿液fibrinogen和ACR成正相關(r=0.65，P＜0.001)。6周時阿霉素處理組小鼠的腎臟PAS染色可見FSGS樣病理改變，電鏡示足突融合程度較生理鹽水處理組嚴重(P＜0.001)。免疫熒光雙重染色結果顯示:阿霉素處理組小鼠腎臟podocin的表達較生理鹽水組顯著減低(P=0.0001);而fibrinogen與TLR4共定位表達