C-myc原癌基因啟動區(qū)G-四鏈體DNA序列對結腸癌細胞增殖的影響.pdf

1、目的：
　　結腸癌(colorectal carcinoma)作為消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，發(fā)病率之高嚴重威脅人類健康，研究表明其發(fā)病機制與癌基因和抑癌基因的表達失調有關。隨著近年來對抗腫瘤藥物的不斷研發(fā)，基因治療已經成為一個研究熱點，大量針對新作用靶點的抗腫瘤基因藥物被逐漸發(fā)現(xiàn)并應用于臨床試驗中，其中G-四鏈體結構是近年來人們關注的重點研究對象之一。
　　G-四鏈體(G-quadruplex)由富含鳥嘌呤的核酸序列旋聚而成，基因

2、啟動區(qū)和端粒末端可以形成G-四鏈體結構，部分小分子藥物可以結合和穩(wěn)定G-四鏈體結構，抑制相關癌基因表達和端粒酶活性從而抑制腫瘤生長。原癌基因c-myc啟動子區(qū)的核酸超敏元件Ⅲ1( NHEⅢ1也叫Pu27)富含鳥嘌呤可以形成分子內G-四鏈體結構從而沉默c-myc基因表達。
　　富含鳥嘌呤寡核苷酸序列(oligonucleotides with guanosine-rich sequences)可以形成G-四鏈體結構，對于大部分腫瘤細

3、胞，一些GRO(G-rich oligonucleotide)表現(xiàn)出高效增殖抑制作用的同時降低了對正常細胞的毒性作用，逐漸成為抗腫瘤治療的新型核酸藥物。Pu27序列可以在體外形成G-四鏈體，通過非轉染方式進入白血病細胞，穩(wěn)定c-myc基因啟動子區(qū)形成的G-四鏈體結構，下調c-myc基因表達抑制增殖，具有抗核酸酶及無需介導直接進入細胞等其他傳統(tǒng)大分子抗癌藥物(如反義寡核苷酸等)所不具備的優(yōu)點。
　　觀察體外Pu27和突變體MutPu

4、27序列對結腸粘膜正常上皮細胞FHC及結腸癌細胞HCT-116、SW480、SW620增殖與凋亡的影響；觀察體外Pu27和突變體MutPu27序列對結腸粘膜正常上皮細胞FHC及結腸癌細胞HCT-116、SW480、SW620原癌基因c-myc表達的影響；初步研究分析體外Pu27序列抑制腫瘤增殖和基因表達的可能分子機制。
　　方法：
　　(1)閱讀文獻并選出核酸類抗癌藥物Pu27序列和特異G堿基突變序列MutPu27并合成；<

5、br>　　(2)以人結腸癌細胞株HCT-116、SW480、SW620和結腸粘膜正常上皮細胞FHC為實驗對象，寡核苷酸序列Pu27和MutPu27以非轉染方式進入細胞并發(fā)揮作用，設立HCT-116/Pu27組、HCT-116/MutPu27組、SW480/Pu27組、SW480/MutPu27組、SW620/Pu27組、SW620/MutPu27組、FHC/Pu27組和FHC/MutPu27組；
　　(3)提取上訴各個分組細胞的m

6、RNA和蛋白，熒光實時定量PCR和Western blotting技術檢測c-myc基因表達水平；FHIC標記Pu27、MutPu27序列觀察細胞的攝取以及在細胞中的穩(wěn)定情況。
　　結果：
　　(1)MTT實驗和流式細胞術檢測結果表明，Pu27序列對三種不同結腸癌細胞有不同程度的抑制增殖作用，其中SW480細胞組敏感性最高，可以促進細胞凋亡,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；
　　(2)RT-PCR和Western b

7、lotting檢測表明，Pu27序列下調c-myc基因表達水平，三種不同結腸癌細胞中SW480細胞組敏感性最高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；
　　(3)細胞攝取實驗結果顯示Pu27通過非轉染途徑在短時間內進入細胞且一定時間內穩(wěn)定存在于細胞中。
　　結論：
　　外源性Pu27寡核苷酸序列通過非轉染方式直接進入細胞，與正常上皮細胞FHC組相比，抑制HCT-116、SW480結腸癌細胞的體外增殖并誘導凋亡，下調c-my