淫羊藿苷對炎癥細胞遷移粘附和血管重構的影響及機制研究.pdf

1、本文分析了淫羊藿苷對炎癥細胞遷移粘附和血管重構的影響。本研究分為兩個部分：
　　第一部分：淫羊藿苷改善野百合堿誘導的肺動脈高壓模型小鼠血管重構。
　　目的：觀察淫羊藿苷（Icariin，ICA）對野百合堿（MCT）所致的CX3CL1-/-小鼠及野生型小鼠肺動脈高壓（PAH）模型的血管重構的影響，分析ICA抗PAH效應與CX3CL1的關系。
　　方法：雄性野生型和CX3CL1-/-小鼠各28只，均隨機分為空白對照組、模型

2、組、ICA組（60 mg/kg）、ICA組（120 mg/kg）。所有小鼠適應性飼養(yǎng)一周后，除空白組外均經頸背部一次性皮下注射MCT（70 mg/kg）建立PAH模型，造模后第7天按分組灌胃給藥，空白對照組及模型組給予等量雙蒸水，每天一次，連續(xù)21 d。給藥21 d后采用B超檢測PAH模型小鼠的左室短軸縮短率（FS）、心臟射血分數（EF）、舒張末期的右室內徑（RVID;d）、左室質量（LV Mass）、左室舒張末期容積（LV Vol;d

3、）、左室收縮末期容積（LV Vol;s）、每搏輸出量（Stroke Volume）；記錄小鼠的死亡率；HE染色觀察肺小動脈病理學變化；測定右室重量、左室+室間隔重量并計算右心室肥大指數（RVHI=RV/LV+S）；免疫熒光法觀察肺小動脈炎癥細胞侵潤情況。
　　結果：CX3CL1-/-小鼠：與空白對照組比較，模型組中FS、EF、Stroke Volume下降（P<0.05或P<0.01），RVID;d、LV Mass、LV Vol;

4、s顯著升高（P<0.05或P<0.01）， LV Vol;d無明顯變化；RVHI增大（P<0.05）；死亡率為12.5％；肺小動脈管壁增厚，管腔狹窄，炎癥細胞侵潤。與模型組比較， ICA給藥組FS、EF明顯升高（P<0.01），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s顯著下降（P<0.05或P<0.01），LV Vol;d、Stroke Volume無明顯變化；RVHI無差異；ICA組（60 mg/kg）死亡率為12.5%、ICA

5、組（120 mg/kg）無死亡；肺小動脈管壁增厚減輕，炎癥細胞侵潤減少。野生型小鼠：與空白對照組比較，模型組中FS、EF顯著下降（P<0.01）， RVID;d、LV Mass、LV Vol;d、LV Vol;s、Stroke Volume顯著升高（P<0.01）；RVHI顯著升高（P<0.01）；死亡率為42.82%。肺小動脈管壁明顯增厚，管腔狹窄，大量炎癥細胞侵潤。與模型組比較，ICA給藥組FS、EF、Stroke Volume明顯

6、升高（P<0.01或P<0.05），RVID;d、LV Mass、LV Vol;s明顯下降（P<0.01或P<0.05）， LV Vol;d無明顯變化；RVHI減輕（P<0.05）；ICA組（60 mg/kg）死亡率為28.57%、ICA組（120 mg/kg）死亡率為14.29%，肺小動脈管壁變薄，管腔增寬，炎癥細胞侵潤減少。CX3CL1-/-小鼠與野生型小鼠比較：與空白對照組比較，模型組中CX3CL1-/-小鼠FS、EF、LV Vo

7、l;d、Stroke Volume高于野生型小鼠，CX3CL1-/-小鼠RVID;d、LV Mass、LV Vol;s低于野生型小鼠，其中FS、EF、LV Vol;d、Stroke Volume（P<0.01或P<0.05），CX3CL1-/-小鼠肺小動脈管壁厚度、管腔大小、炎癥細胞量低于野生型小鼠；ICA組CX3CL1-/-小鼠FS、EF、LV Vol;d、LV Vol;s、Stroke Volume高于野生型小鼠，RVID;d、LV

8、 Mass低于野生型小鼠，其中ICA組（60 mg/kg） Stroke Volume（P<0.05），ICA組（120 mg/kg）LV Mass（P<0.01），CX3CL1-/-小鼠肺小動脈管壁厚度、管腔大小、炎癥細胞量低于野生型小鼠，且ICA組（120 mg/kg）效果高于ICA組（60 mg/kg）。
　　結論：ICA可改善MCT誘導的PAH模型小鼠的血流動力學和肺血管重構，ICA對CX3CL1-/-小鼠PAH模型的改善

9、作用較野生型小鼠差。
　　第二部分：淫羊藿苷通過下調NF-κB/CX3CL1抑制TNF-α誘導的單核細胞向人臍靜脈內皮細胞遷移和黏附。
　　目的：研究淫羊藿苷（icariin，ICA）對TNF-α誘導的單核細胞（THP-1）向人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）遷移和黏附的影響及其機制。
　　方法：⑴免疫熒光染色鑒定CX3CL1、CX3CR1蛋白分別在HUVECs和THP-1表達情況。⑵采用Transwells聯合培養(yǎng)TH

10、P-1（上室）和HUVECs（下室），分為對照組(control)、模型組(TNF-α)、ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）組和DMSO(溶媒對照，0.1%)組，TNF-α誘導THP-1向HUVECs遷移和黏附，ICA預給藥4h后加入TNF-α(10 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24h，移除Transwells，并對培養(yǎng)液中的THP-1計數，即為遷移細胞數；免疫熒光雙標法檢測THP-1向HUVECs黏附的情況；ELISA檢測HU

11、VECs膜結合型CX3CL1（mCX3CL1）、培養(yǎng)基中溶解型CX3CL1（sCX3CL1）蛋白量；Western blot檢測HUVECs中CX3CL1、THP-1中CX3CR1、IκB-α、P-NF-κB(p65)蛋白量。⑶選用NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸（PDTC）為陽性對照，分析 ICA抑制 THP-1遷移黏附作用與NF-κB/CX3CL1信號通路的關系。將Transwells聯合培養(yǎng)的THP-1（上室）和HUVECs（下

12、室）分為對照組(control)、模型組（TNF-α)、ICA10-6 mol/L組、PDTC（50μmol/L）組，ICA和PDTC預給藥4h后加入TNF-α繼續(xù)培養(yǎng)24h；THP-1遷移黏附及sCX3CL1和mCX3CL1蛋白量檢測方法同上；免疫熒光檢測NF-κB核轉錄情況；Western blot檢測IκB-α、P-NF-κB(p65)蛋白的表達。⑷為了進一步證實ICA抑制THP-1遷移和黏附與CX3CL1的關系，采用Transw

13、ells聯合培養(yǎng)THP-1和HUVECs，CX3CL1誘導THP-1向HUVECs遷移和黏附，并觀察ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）對該模型的影響。ICA預給藥4h后加入CX3CL1(50 ng/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24h， THP-1遷移黏附檢測方法同上；Western blot檢測CX3CR1、P-NF-κB p65和TNF-α蛋白水平。
　　結果：HUVECs和THP-1有CX3CL1、CX3CR1蛋白表達。與對

14、照組比較，TNF-α(10 ng/mL)能夠誘導 THP-1向 HUVECs的遷移和黏附、提高 sCX3CL1、mCX3CL1、CX3CL1和CX3CR1的蛋白水平，激活NF-κB。ICA（10-8、10-7、10-6 mol/L）能抑制TNF-α刺激的THP-1向HUVECs遷移和黏附(P＜0.01或P＜0.05），降低sCX3CL1、mCX3CL1、CX3CL1和CX3CR1蛋白水平(P＜0.01或P＜0.05），抑制NF-κB p

15、65的磷酸化水平和阻斷IκB蛋白的降解(P＜0.01或P＜0.05）。PDTC也能起到與ICA同樣的作用，ICA的效果稍高于PDTC。此外，與對照組比較，CX3CL1誘導THP-1向HUVECs遷移和黏附的數量明顯增多(P＜0.01），伴有CX3CR1、p-NF-κB p65、TNF-α蛋白水平升高（P＜0.05）；ICA預處理（10-8～10-6 mol/L）能減少THP-1向HUVECs遷移和黏附的數量（P＜0.05或 P＜0.01