腹腔鏡胃癌手術相關炎癥因子對胃癌細胞腹膜粘附的影響及機制的初步研究.pdf

1、背景和目的:
　　 胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,死亡率居惡性腫瘤第二位。腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的常見方式,也是胃癌術后復發(fā)、死亡的主要原因之一。胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制目前尚不清楚,根據(jù)經(jīng)典的“種子-土壤”學說,胃癌腹腔轉(zhuǎn)移包括如下三個重要環(huán)節(jié):1.胃癌細胞從原發(fā)灶脫落;2.腹腔游離胃癌細胞與腹膜間皮細胞粘附;3.胃癌細胞突破腹膜間皮屏障進入間皮下基質(zhì)。任何影響上述三個環(huán)節(jié)的因素都將對胃癌腹腔轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。其中在適宜的局部微環(huán)境下,

2、游離癌細胞與腹膜間皮細胞相互粘附是其發(fā)生的基礎。而在眾多影響腫瘤局部微環(huán)境的因素中,炎癥與腫瘤的關系目前已得到國內(nèi)外學者的廣泛認同,近年已將炎癥視為腫瘤所具有的七類重要特征之一。
　　 手術創(chuàng)傷會刺激機體發(fā)生反應性炎癥應答,進而引起腹腔內(nèi)多種細胞釋放一系列炎癥因子和生長因子,其中最常見的為腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-1β(IL-1β)。這些炎癥因子通過趨化巨噬細胞、中性粒細胞向創(chuàng)傷處遷移從而有利于創(chuàng)傷的愈合。然而目前

3、的研究也發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β參與腫瘤生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移等多個過程。TNF-α和IL-1β作為體內(nèi)兩類多功能細胞因子均可激活細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路,而該通路活化后可促進不同的基因轉(zhuǎn)錄。其中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)、血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)等粘附分子的啟動子區(qū)既有NF-κB的結(jié)合位點,因此TNF-α和IL-1β可能具有調(diào)節(jié)ICAM-1、VCAM-1等粘附分子表達的作用。粘附分子的異常或過量表

4、達能促進腫瘤細胞與其它的腫瘤細胞、正常細胞以及細胞外基質(zhì)成分粘附從而有利于游離癌細胞轉(zhuǎn)移,然而關于TNF-α和IL-1β是否會促進胃癌細胞與腹膜間皮細胞粘附,以及它們對胃癌腹腔轉(zhuǎn)移是否有影響目前尚未見報道。
　　 目前根治性手術切除仍然是胃癌患者獲得治愈的惟一途徑,腹腔鏡手術治療惡性腫瘤能達到開腹手術的根治效果,且具有腹壁切口小、術中失血少、術后恢復快等微創(chuàng)優(yōu)勢,因此是近年來微創(chuàng)胃腸外科研究熱點。在日本早期胃癌行腹腔鏡手術治療已

5、成為標準術式之一,但是對于進展期胃癌行腹腔鏡手術治療是否會促進胃癌術后腹膜轉(zhuǎn)移仍是目前外科醫(yī)師關注的焦點。TNF-α和IL-1β在由創(chuàng)傷刺激引起的急性期反應中發(fā)揮重要作用,并且這兩種炎癥因子的表達改變與手術創(chuàng)傷程度的大小及術后相關并發(fā)癥的發(fā)生具有密切聯(lián)系。因而目前普遍認為TNF-α和IL-1β可以作為評估手術創(chuàng)傷程度的兩個重要指標。那么腹腔鏡手術的微創(chuàng)特點是否具有對因創(chuàng)傷引起的炎癥因子釋放影響小的優(yōu)勢,進而可能有利于減輕炎癥因子所介導的

6、胃癌腹膜轉(zhuǎn)移呢?
　　 為此本課題首先體外原代培養(yǎng)人腹膜間皮細胞,利用不同濃度的TNF-α或JL-1β分別處理腹膜間皮細胞,然后觀察其對腹膜間皮細胞與胃癌細胞粘附的影響,并采用Real-time PCR方法檢測TNF-α和IL-1β對腹膜間皮細胞不同粘附分子mRNA表達的影響。為進一步闡述粘附分子及其配體對胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過程的影響,本研究采用免疫組化染色方法檢測胃癌組織和腹膜組織中粘附分子及其配體表達情況。同時通過ELISA法檢測

7、腹腔鏡胃癌手術和開腹胃癌手術患者血液及腹腔沖洗液中TNF-α和IL-1β濃度的變化。期望通過以上研究初步探討FNF-α和IL-1β對胃癌細胞腹膜粘附的影響,進而為臨床防治胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的發(fā)生提供新的理論和實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.以體外原代培養(yǎng)腹膜間皮細胞為實驗對象,實驗分為處理組和對照組,其中處理組又分為炎癥因子處理組和抗炎癥因子處理組。在炎癥因子處理組中人腹膜間皮細胞經(jīng)不同濃度TNF-α或IL-1β處理后與胃

8、癌細胞共培養(yǎng),通過流式細胞儀檢測細胞間黏附率。在抗炎癥因子處理組中不同濃度的TNF-α或IL-1β抑制劑分別阻斷TNF-α或IL-1β后再處理人腹膜間皮細胞,處理后的人腹膜間皮細胞與胃癌細胞共培養(yǎng)并通過流式細胞儀檢測細胞間黏附率。對照組中以PBS代替TNF-α或IL-1β。
　　 2.人腹膜間皮細胞經(jīng)不同濃度FNF-α或IL-1β處理后,采用Real-time PCR方法檢測腹膜間皮細胞中CD44、ICAM-1以及VCAM-1m

9、RNA表達情況。
　　 3.采用Real-time PCR方法檢測人胃腺癌細胞株中ICAM-1配體:淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、VCAM-1配體:極遲抗原-4(VLA-4)以及CD44mRNA的表達;
　　 4.收集本中心胃癌手術患者的腹膜組織及胃癌組織。通過免疫組化染色檢測腹膜組織中ICAM-1、VCAM-1、CD44v6的表達;同時檢測胃癌組織中LFA-1、VLA-4以及CD44v6的表達。
　　

10、 5.以本中心57例行胃癌根治術患者為研究對象。其中32例患者行腹腔鏡手術治療(腹腔鏡手術組),同期25例患者行開腹手術治療(開腹手術組)。通過ELISA法檢測兩組手術患者腹腔沖洗液及血液中TNF-α和IL-1β濃度的變化。兩組病人的腹腔沖洗液均收集3次,即開腹后或建立氣腹后和術后24、48小時;血液標本均收集5次,即麻醉誘導后和術后2、4、24及48小時。
　　 結(jié)果:
　　 1.原代培養(yǎng)人腹膜間皮細胞經(jīng)不同濃度TNF

11、-α或IL-1β處理后,其與胃癌細胞的黏附率逐漸升高,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。并且這種作用與炎癥因子的濃度之間呈明顯量效關系,當TNF-α或IL-1β濃度達到10ng/ml時細胞間粘附率達到最大值,隨后粘附率并不因炎癥因子濃度的增加而升高。同時這種作用可以分別被TNF-α或IL-1β的抑制劑所阻斷。
　　 2.TNF-α和IL-1β均可促進人腹膜間皮細胞中ICAM-1、VCAM-1及CD44mRNA表達上調(diào)

12、,并且呈明顯量效關系即隨著TNF-α或IL-1β濃度增加,這些粘附分子mRNA表達水平逐漸增高。與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　 3.人胃腺癌細胞株AGS、SGC.7901、MKN-45中CD44、LFA-1和VLA-4mRNA均呈陽性表達。
　　 4.免疫組化染色結(jié)果表明人腹膜組織中ICAM-1、VCAM-1及CD44v6表達陽性;胃癌組織中LFA-1、VLA-1及CD44v6表達陽性。
　　

13、 5.手術后兩組患者腹腔沖洗液中TNF-α和IL-1β濃度均顯著升高,在術后24小時達到高峰,其中開腹組患者腹腔沖洗液中IL-1β濃度高于腔鏡組,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而兩組患者腹腔沖洗液中TNF-α濃度比較無明顯差異(P＞0.05)。隨后兩組患者腹腔沖洗液中TNF-α和IL-1β濃度逐漸下降,在術后48小時開腹組患者腹腔沖洗液中TNF-α和IL-1β濃度均高于腹腔鏡組,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。<

14、br>　　 6.手術后兩組患者血液中TNF-α和IL-1β濃度均顯著升高,在術后4小時達到高峰,然后開始逐漸下降。其中開腹組患者血液中IL-1β濃度高于腹腔鏡組,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。而兩組患者血液中TNF-α濃度比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.炎癥因子TNF-α和IL-1β通過上調(diào)人腹膜間皮細胞粘附分子ICAM-1、VCAM-1及CD44的表達,促進胃癌細胞與腹膜間皮細胞

15、間相互黏附,從而在胃癌細胞腹腔種植轉(zhuǎn)移中發(fā)揮正性促進作用。這可能是炎癥因子促進胃癌腹腔轉(zhuǎn)移的重要機制之一。
　　 2.TNF-α和IL-1β抑制劑可阻斷TNF-α和IL-1β對腹膜間皮細胞與胃癌粘附的促進作用,因而可能具有預防胃癌術后發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的作用。
　　 3.與傳統(tǒng)開腹胃癌手術相比,腹腔鏡胃癌手術具有腹壁切口小、術中出血少、術后恢復快等優(yōu)勢。并且其對腹腔局部和機體系統(tǒng)炎癥反應影響小,炎癥因子分泌水平較傳統(tǒng)開腹手術低