慢性心理應(yīng)激影響大鼠細(xì)胞自噬功能的時(shí)相性研究.pdf

1、目的:
　　把慢性心理應(yīng)激與中醫(yī)情志病聯(lián)系起來(lái)，根據(jù)中醫(yī)七情內(nèi)傷，最先傷肝的病因理論，觀測(cè)比較不同的慢性心理應(yīng)激時(shí)間所導(dǎo)致的病位演變及證候變化規(guī)律，以及海馬神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞等體細(xì)胞內(nèi)自噬活動(dòng)的變化情況。為下一步中醫(yī)藥抗應(yīng)激損傷的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究摸索最佳造模時(shí)間，也為從細(xì)胞自噬角度闡釋肝主疏泄的藏象理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　根據(jù)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)5分鐘活動(dòng)距離，大鼠隨機(jī)分為空白組、造模10天組、造模20天組、造模30天組和造

2、模40天組5組，六種造模方法（禁食、禁水、冰水游泳、夾尾、電擊、束縛）隨機(jī)安排在實(shí)驗(yàn)過程中，以曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)判斷慢性心理應(yīng)激模型的建立時(shí)間，酶聯(lián)免疫法分析大鼠血清胃動(dòng)素、胃泌素，慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬體的影響，慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:
　　1、慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠空間記憶及學(xué)習(xí)能力和抑郁情緒的影響
　　各組大鼠造模前曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總路程無(wú)差異（P＞0.05）。

3、造模后，與空白組相比，5分鐘活動(dòng)總路程造模10天組距離縮短，但無(wú)差異（P＞0.05）;造模20天組活動(dòng)距離明顯縮短，有差異（P＜0.05）;造模30天組、40天組活動(dòng)距離縮短，有明顯差異(P＜0.01)。前3分鐘活動(dòng)總路程，與空白組相比，造模10天組活動(dòng)距離縮短，有差異（P＜0.05）;造模20天組、造模30天組、40天組活動(dòng)距離明顯縮短，有顯著差異(P＜0.01)。
　　2、慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠胃腸激素的影響
　　各組大鼠造

4、模結(jié)束后取血，測(cè)定血清胃動(dòng)素、胃泌素，與空白組相比，造模10天組血清胃動(dòng)素下降，有差異（P＜0.05）;造模20天組、30天組、40天組胃動(dòng)素下降明顯，有顯著差異（P＜0.01）。與空白組比較，造模10天組、20天組血清胃泌素下降，但無(wú)差異（P＞0.05）;造模30天組、40天組下降明顯，與空白組相比有差異（P＜0.05）。而且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清胃腸激素呈逐步下降趨勢(shì)。
　　3、慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠細(xì)胞自噬相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影

5、響
　　3.1慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白TSC2的影響
　　各組大鼠造模結(jié)束后取材進(jìn)行倒置顯微鏡觀察，免疫組化染色后細(xì)胞質(zhì)顯示黃褐色，核呈現(xiàn)藍(lán)色?？瞻捉M大鼠海馬區(qū)顯示，黃色區(qū)域分布少，造模10天組與空白組相比陽(yáng)性表達(dá)率上升，但無(wú)差異(P＞0.05);造模20天組與空白組陽(yáng)性表達(dá)率相比，上升，有差異（P＜0.05）;空白組與造模30天組、40天組相比有顯著差異（P＜0.01）。空白組大鼠肝索清楚，細(xì)胞形態(tài)清晰，造模10

6、天組與空白組相比陽(yáng)性表達(dá)率上升，無(wú)差異(P＞0.05);造模20天組、30天組、40天組與空白組相比有顯著差異(P＜0.01)。
　　3.2慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白ULK1的影響
　　海馬神經(jīng)細(xì)胞中ULK1的表達(dá)，造模10天組與空白組相比陽(yáng)性表達(dá)率上升，但無(wú)差異(P＞0.05)，造模20天組與空白組陽(yáng)性表達(dá)率相比，上升，有差異（P＜0.05）;空白組與造模30天組、40天組相比有顯著差異（P＜0.01）?？瞻捉M大鼠

7、肝索清楚，細(xì)胞形態(tài)清晰，造模10天組與空白組相比陽(yáng)性表達(dá)率上升，但無(wú)差異（P＞0.05）;造模20天組與空白組陽(yáng)性表達(dá)率相比，上升，有差異(P＜0.05);造模30天組、40天組與空白組陽(yáng)性表達(dá)率相比有顯著差異(P＜0.01)。
　　4、慢性心理應(yīng)激對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)自噬體的影響
　　各組大鼠造模結(jié)束后取材進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察，比較海馬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)，空白組大鼠可見海馬神經(jīng)細(xì)胞胞壁完整，胞漿充盈，細(xì)胞形態(tài)清晰，無(wú)腫脹壞死，有

8、少數(shù)自噬體可見;造模10天組海馬神經(jīng)細(xì)胞胞壁相對(duì)完整，胞漿充盈，腫脹壞死較少，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形態(tài)清晰，自噬體數(shù)量少;造模20天組海馬神經(jīng)細(xì)胞胞壁較完整，胞漿相對(duì)充盈，腫脹壞死少，可見少量自噬體;造模30天組海馬神經(jīng)細(xì)胞胞壁不完整，胞漿少，腫脹壞死，雙層膜包裹的自噬體數(shù)量較多，內(nèi)含待降解物;造模40天組海馬神經(jīng)細(xì)胞胞壁破壞，腫脹壞死，可見大量雙層膜包裹的自噬體或自噬溶酶體，胞質(zhì)模糊不清，含有較多待降解物，核內(nèi)染色體彌散不清?？瞻捉M大鼠海馬CA

9、1區(qū)的自噬體數(shù)目明顯少于造模組，與造模10天組無(wú)差異（P＞0.05），與造模20天組有差異（P＜0.05），與造模30天組、40天組有明顯差異（P＜0.01），空白組自噬體數(shù)目最少，而造模40天組自噬體數(shù)目最多。
　　結(jié)論:
　　曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)有效的測(cè)定了慢性心理應(yīng)激的造模時(shí)間，慢性心理應(yīng)激影響大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力并出現(xiàn)情緒抑郁，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)激時(shí)間越長(zhǎng)，抑郁越嚴(yán)重，曠場(chǎng)活動(dòng)距離越短。通過對(duì)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)距離的測(cè)定及比較，將造模30天

10、作為慢性心理應(yīng)激最佳時(shí)間。
　　慢性心理應(yīng)激可以影響胃腸激素的釋放，不同的造模時(shí)間下，胃腸激素水平不同。造模時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)激的加劇，胃腸激素水平下降。慢性心理應(yīng)激影響了肝主疏泄功能的正常發(fā)揮，導(dǎo)致肝失疏泄，“見肝之病，知肝傳脾”，肝病傳脾，使脾胃受損，功能失調(diào)。因此，慢性心理應(yīng)激隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，證候可能發(fā)生變化，由肝郁氣滯向肝郁脾虛轉(zhuǎn)化。
　　慢性心理應(yīng)激影響海馬CA1區(qū)細(xì)胞自噬，引起自噬的過度激活，造成該區(qū)細(xì)胞的損傷。隨著