松脂醇二葡萄糖苷對血管內皮細胞氧化損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　近年隨著人們生活水平的提高和人口老齡化，動脈粥樣硬化(arteriosclerosis，AS)的發(fā)病率呈不斷升高趨勢。作為一種嚴重危害人類健康的疾病，動脈粥樣硬化的發(fā)病過程極為復雜，尋找其確切病因及發(fā)病機制一直是醫(yī)學科研工作者研究的方向。
　　動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥疾病，血管內皮損傷和功能障礙是AS發(fā)生的始動環(huán)節(jié)。盡管致內皮損傷因素很多，但內皮細胞的氧化損傷倍受人們關注，被認為是AS的重要致病因素。研究證實，

2、在外界刺激條件下，血管內皮細胞中的抗氧化機制受損，破壞細胞氧化還原自穩(wěn)態(tài)，從而使細胞內活性氧(ROS)大量蓄積發(fā)生氧化反應。氧化反應的主要產物包括氧化的低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)和凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體(lectin-like oxidized low-density lipoprotein-1，LOX-1)，二者表達的異常均可導致血管內皮細胞功能損傷。其中，LO

3、X-1是ox-LDL的特異性受體之一，主要在內皮細胞表達。LOX-1與ox-LDL二者結合可誘導細胞間粘附分子-1(ICAM-1)，血管細胞粘附分子-1(VCAM-1)及單核細胞趨化因子-1(MCP-1)等炎癥相關基因的表達，使得單核細胞粘附于血管內皮表面并遷入內皮攝取脂質，并同時引發(fā)內皮細胞中的炎癥反應，造成內皮細胞的結構損傷與功能障礙，最終引發(fā)或加重動脈粥樣硬化。
　　血管內皮細胞的凋亡與動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展也密切相關，細胞

4、對外界刺激的響應多通過細胞內的信號轉導途徑來實現(xiàn)，其中與細胞氧化損傷關系最為密切的一條信號通路為p38MAPK/NF-κB。研究證實，ox-LDL/LOX-1可激活p38MAPK/NF-κB信號通路，ox-LDL誘導LOX-1和ICAM-1蛋白的表達是通過對這條通路的調控來實現(xiàn)的。脂質代謝紊亂也是誘發(fā)AS的危險因素，臨床上降血脂藥物如他汀類藥物可對AS進行干預，松脂醇二葡萄糖苷(pinoresinol diglucoside，PDG)是

5、一種從杜仲中提取的雙環(huán)氧木脂素，具有降血壓、降血脂、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等藥理作用。研究顯示，PDG對血管內皮具有一定的保護作用，但PDG的這種血管保護作用是否是通過減輕內皮細胞的氧化損傷而實現(xiàn)？其具體保護作用機制是什么？目前國內外未見相關報道，這正是本課題所要研究的主要內容，以期為尋找新的抗AS藥物作用靶點提供實驗依據(jù)。
　　本研究分兩部分:(1)建立高脂小鼠模型，給予PDG處理，并以阿托伐他汀為陽性對照，研究PDG對血管內皮的

6、保護作用，及其是否通過干預內皮細胞氧化損傷發(fā)揮作用？(2)利用人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)在體外構建ox-LDL誘導的內皮細胞氧化損傷模型，探究PDG是否通過影響p38MAPK/NF-κB信號通路而抑制由ox-LDL誘導的內皮細胞氧化損傷？
　　方法：
　　1、高脂小鼠實驗
　　1.1、高脂模型的建立及分組
　　8周齡Apoe小鼠高

7、脂喂養(yǎng)，隨機分4組:①高脂模型組;②低濃度PDG組（5mg/kg/d灌胃，隔天給藥，連續(xù)給藥4周）;③高濃度PDG組(10mg/kg/d灌胃，隔天給藥，連續(xù)給藥4周);④陽性對照組（阿托伐他汀10mg/kg/d，隔天給藥，連續(xù)給藥4周），以上每組5只。另取野生小鼠3只為正常對照組（正常飲食8周）。5組動物均飼養(yǎng)8周后處死，取材、檢測。
　　1.2、血管內皮細胞形態(tài)學檢測
　　取小鼠胸主動脈組織進行HE染色，觀察血管內皮細胞的

8、形態(tài)學變化。
　　1.3、血管內皮氧化損傷指標檢測
　　分別用相應試劑盒檢測總膽固醇(total cholesterol，TC)、ox-LDL、NO含量及MDA含量;采用real time RT-PCR檢測LOX-1及ICAM-1mRNA的表達。
　　2、體外細胞實驗
　　2.1、內皮細胞氧化損傷模型的建立及分組
　　細胞系為人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)。前期已通過預實驗確定ox-LDL的最低作用濃度為

9、100μg/mL，其最佳檢測時間為24h;同時確定PDG的最佳作用濃度為0.1μM;SB203580(SB)是p38MAPK信號通路的特異性抑制劑。
　　分為6組:①正常對照組:HUVECs;②ox-LDL模型組:ox-LDL-HUVECs;③高濃度PDG組:ox-LDL-HUVECs+PDG(1μM);④低濃度PDG組:ox-LDL-HUVECs+PDG(0.1μM);⑤SB抑制劑組:ox-LDL-HUVECs+SB(10μmo

10、l/L);⑥PDG+SB抑制劑組:ox-LDL-HUVECs+PDG(1μM)+SB(10μmol/L)。
　　2.2、細胞凋亡檢測
　　取對數(shù)生長期的HUVECs，采用流式細胞術檢測細胞凋亡情況。
　　2.3、各指標檢測
　　利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧(ROS)水平檢測;分別用相應的試劑盒檢測NO水平、MDA含量、SOD活性;采用real time RT-PCR檢測LOX-1、ICAM-1、NF-κB

11、、eNOS和iNOS mRNA的表達;Western blot檢測LOX-1、ICAM-1、p38MAPK及NF-κdB蛋白的表達。
　　結果：
　　1、高脂模型小鼠
　　1.1、血管內皮細胞形態(tài)學檢測結果
　　HE染色結果顯示，與正常對照組比較，高脂模型組中血管內皮細胞明顯腫大、變圓，損傷顯著;與高脂模型組比較，陽性對照組與PDG組的內皮細胞腫脹均明顯減輕。
　　1.2、血管內皮氧化損傷指標檢測結果

12、>　　與正常對照組比較，高脂模型組中TC含量、MDA含量、ox-LDL含量、LOX-1和ICAM-1的mRNA表達均顯著升高，NO水平明顯下降(P＜0.05);與高脂模型組比較，PDG組及陽性對照組的TC、MDA及ox-LDL含量均顯著降低，LOX-1與ICAM-1mRNA的表達顯著下調，NO水平顯著升高(P＜0.05)。PDG組中這些指標的含量及表達均呈濃度—依賴效應。
　　2、體外細胞實驗
　　2.1、細胞凋亡檢測結果<

13、br>　　與正常對照組比較，ox-LDL模型組HUVECs凋亡率明顯升高(P＜0.05);與模型組比較，PDG及SB抑制劑均顯著降低HUVECs凋亡率(P＜0.05)。
　　2.2、各指標檢測結果
　　與正常對照組相比，ox-LDL模型組中ROS、MDA含量，LOX-1、ICAM-1、NF-κB和iNOS mRNA的表達，以及p38MAPK及NF-κB蛋白表達均顯著升高;SOD酶活性及NO水平、eNOS mRNA的表達顯著下

14、降(P＜0.05);與模型組比較，PDG及SB抑制劑均明顯降低ROS、MDA含量，并顯著下調LOX-1、ICAM-1、NF-κB、iNOS mRNA的表達及p38MAPK和NF-κB蛋白表達(P＜0.05);SOD酶活性、NO水平及eNOS mRNA的表達則顯著增強(P＜0.05)。
　　結論：
　　1、PDG可減少高脂小鼠血清TC及ox-LDL含量，降低脂質過氧化產物MDA含量，升高NO水平，下調內皮細胞中LOX-1mRN

15、A和ICAM-1mRNA表達，對高脂小鼠血管內皮氧化損傷具有一定的保護作用。
　　2、PDG可拮抗ox-LDL誘發(fā)的HUVECs的氧化損傷，提高內皮細胞抗氧化酶SOD活性，升高NO水平，上調eNOS mRNA表達，下調iNOS mRNA表達，降低MDA及ROS水平，減少內皮細胞中LOX-1和ICAM-1的表達，達到提高內皮細胞抗氧化能力的效果，對抗脂質過氧化造成的內皮細胞損傷。
　　3、PDG可通過抑制p38MAPK/NF-