蠟梅水通道蛋白CpAQPl轉錄水平變化及其啟動子活性分析.pdf

1、張迷(2009)等人在已構建的蠟梅花cDNA文庫及EST分析的基礎上得到了2個蠟梅水通道蛋白基因CpAQP1和CpAQP2。通過構建植物表達載體,利用根癌農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉化煙草,對轉基因煙草進行干旱、高鹽、高溫處理,發(fā)現(xiàn)轉基因煙草的耐受性比非轉基因煙草有顯著提高,初步證明蠟梅水通道蛋白與植物抗逆性有關。為了進一步驗證和探索該基因的功能,可以通過研究該基因轉錄水平變化和分析啟動子調控區(qū)域說明CpAQP1在抗逆性及其他生理功能中可能起到

2、的作用。因此,本研究在張迷等人的基礎上,利用熒光定量PCR技術對蠟梅花發(fā)育的各個花期、各個組織和不同脅迫下的水通道蛋白CpAQP1的表達量進行分析,并利用hi-TAILPCR技術克隆蠟梅水通道蛋白基因CpAQP1基因啟動子區(qū)域1082bp,利用生物信息學軟件對其進行分析,并構建植物表達載體,通過根癌農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉化模式植物煙草,研究該啟動子活性。本文主要研究結果如下:
　　 1、CpAQP1基因的表達分析
　　 實

3、時熒光定量PCR分析表明:CpAQP1在蠟梅不同組織中的表達量不同,盛開期花瓣中的表達量最高,該基因的表達可能具有發(fā)育階段特異性;在高溫、低溫、高鹽、ABAA和重金屬不同非生物脅迫處理下,CPAQP1的表達量變化趨勢也存在差異.結果說明CPAQP1可能在蠟梅的生長發(fā)育、細胞衰老和非生物脅迫應答的過程中發(fā)揮作用.
　　 2、CpQP1啟動子的克隆
　　 在CpQP1基因ORF的5'端設計三條巢式引物,利用Liu等人改良的T

4、AIL-PCR:hiTAIL-PCR法擴增到蠟梅水通道蛋白基因CpQP1的5'啟動子1082bp,命名為CpQP1pro(GenBank登錄號:JQ952563)。
　　 3、CpAQP1pro啟動子序列分析
　　 用PlantCare軟件對CpAQP1pro進行分析,該啟動子除了具有TATA-box和CAAT-box等基本轉錄元件外,還有光應答元件、茉莉酸甲酯應答順式調控元件、水楊酸應答元件、脅迫相關應答元件、胚乳表達

5、必須的順式作用元件。
　　 4、植物表達載體構建
　　 通過酶切和連接將該啟動子代替植物表達載體PBI121中的35s啟動子與GUS報告基因相連,通過PCR和雙酶切驗證結果,說明已成功構建植物表達載體PBI121-CpAQP1pro。
　　 5、煙草轉化及活性分析
　　 利用根癌農(nóng)桿菌介導的葉盤法將轉入表達載體的PBI121-CPAQP1pro轉入野生型煙草,通過對轉基因煙草葉片GUS組織化學染色,結果說