乙肝病毒X蛋白通過長非編碼RNA HULC促進肝癌細胞增殖的作用及分子機制研究.pdf

1、乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是導致肝細胞肝癌(HCC)的發(fā)生的重要原因，乙肝病毒X蛋白(HBx)在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。HBx蛋白對于HBV本身復制具有重要作用，具有反式激活功能，通過與多個癌基因相互作用和參與細胞信號轉(zhuǎn)導通路來影響細胞周期，進而影響細胞的增殖，同時也能與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合直接調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄。長非編碼RNA(Longnon coding RNA，LncRNA)可通過多種途徑調(diào)節(jié)

2、靶基因表達，參與調(diào)控細胞的生長、發(fā)育、衰老和死亡等過程。LncRNA可通過干擾轉(zhuǎn)錄、引起染色體重塑、組蛋白修飾、改變蛋白質(zhì)定位和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等調(diào)節(jié)作用發(fā)揮功能。LncRNAHULC(highly7up-regulated in liver cancer，HULC)是一種在肝癌中高表達的長非編碼RNA，但其在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用迄今不清。為了進一步闡明長非編碼RNA HULC是否參與HBx致癌的過程，本文探討了LncRNAHULC在

3、HBx促進肝癌細胞增殖的作用及其分子機制。主要內(nèi)容如下：
　　 第一部分：HBx上調(diào)HULC的作用及其分子機制首先，通過Real-time PCR檢測了21例臨床肝癌組織和其癌旁組織中HULC的表達水平。結(jié)果顯示，與癌旁相比HULC在肝癌組織中高表達。在33例肝癌標本(包括上述21例肝癌組織)中發(fā)現(xiàn)HBx mRNA的表達水平與HULC的表達水平呈正相關(guān)。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對照組相比HULC在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx的肝

4、細胞L-O2-X和肝癌HepG2-X細胞中表達上調(diào)，通過RNA干擾HBxmRNA，可下調(diào)HULC的表達，呈劑量依賴性；在人永生化肝細胞L-O2中瞬時轉(zhuǎn)染HBx，HULC的表達水平發(fā)生上調(diào)，呈劑量依賴性。為了進一步研究HBx上調(diào)HULC的分子機制，首先克隆了HULC的啟動子核心區(qū)，雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，在L-O2細胞中過表達HBx可激活HULC啟動子的活性，呈劑量依賴性，而在HepG2-X細胞中干擾HBx mRNA后HULC的表達水

5、平發(fā)生下調(diào)，呈劑量依賴性。HULC啟動子區(qū)含有cAMP response element-binding(CREB)結(jié)合位點。當干擾CREB mRNA或?qū)ULC啟動子的CREB結(jié)合位點突變，應用雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)，L-O2-X和HepG2-X細胞中HULC的啟動子活性明顯下降。應用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗進一步證實，HBx可通過直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子CREB上調(diào)HULC的表達。
　　 第二部分：LncRNA HULC促進肝癌細胞

6、增殖的作用HULC對肝癌細胞調(diào)節(jié)的功能不清。為了探討HBx是否通過HULC促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，應用MTT方法檢測了瞬時過表達HULC對L-O2肝細胞增殖的影響。結(jié)果顯示，過表達HULC可明顯促進肝細胞增殖，呈時間依賴性；反之，在L-O2-X和HepG2-X中干擾HULC則可抑制上述細胞的生長，呈時間依賴性。EdU檢測顯示，在HepG2-X細胞中干擾HuLC可顯著抑制肝癌細胞的增殖；克隆形成實驗顯示，在HepG2-X細胞中干擾HULC可明

7、顯降低細胞的克隆形成能力；裸鼠動物成瘤實驗結(jié)果顯示，在HepG2-X細胞中干擾HULC可顯著降低肝癌細胞的成瘤能力，進一步應用Realtime PCR檢測，與對照組相比在移植瘤組織中HULC的水平明顯降低。因此，LncRNA HULC具有促進肝癌細胞增殖的作用。
　　 第三部分：LncRNA HULC促進肝癌細胞增殖分子機制的研究為了進一步研究LncRNA HULC促進肝癌細胞增殖的分子機制，通過檢索HULC基因所在的6p24.

8、3區(qū)域的編碼基因，發(fā)現(xiàn)HULC基因附近存在SLC3583和抑癌基因p18兩個編碼基因。文獻報道，HULC對SLC3583調(diào)節(jié)作用并不明顯，因此我們探討了HULC對p18的調(diào)控作用。我們首先檢測了上述21例肝癌組織和癌旁組織中p18的表達水平，發(fā)現(xiàn)p18在肝癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，并且在上述33例肝癌組織中發(fā)現(xiàn)p18的表達水平與HULC的表達水平呈負相關(guān)。在HepG2細胞中干擾HULC，顯示p18的mRNA水平和蛋白水平發(fā)生上

9、調(diào)，呈劑量依賴性。將p18基因(-1003到+349nt)克隆到pGL3-Basic載體上，報告基因結(jié)果顯示，該區(qū)域具有啟動子活性。報告基因顯示，在肝細胞L-O2中過表達HULC可抑制p18的啟動子活性，呈劑量依賴性；當干擾HepG2細胞中HULC，可激活p18的啟動子活性，呈劑量依賴性。上述結(jié)果表明，HULC通過抑制p18基因的啟動子活性進而抑制p18的表達。MTT分析結(jié)果顯示，雙干擾p18和HULC，發(fā)現(xiàn)干擾HULC可以降低干擾p1

10、8促進細胞增殖的能力。檢測動物實驗腫瘤組織中p18的表達水平，結(jié)果顯示在si-HULC組的移植瘤組織中p18蛋白的表達水平明顯高于si-Ctrl組，進一步證實了si-HULC抑制肝癌細胞增殖的作用與上調(diào)p18有關(guān)。
　　 第四部分：HULC和p18在HBx促進肝癌細胞增殖中的作用為了探討HULC和p18在HBx促進肝癌細胞增殖中的作用，對L-O2/L-O2-X(HepG/HepG2-X)中p18的蛋白水平進行了比較。免疫印跡結(jié)果

11、顯示，與L-O2或HepG2相比，L-O2-X或HepG2-X細胞中p18蛋白的表達水平明顯下調(diào)；反之，在L-O2-X或HepG2-X細胞中干擾HBx mRNA可導致p18的表達水平上調(diào)，表明HBx具有下調(diào)p18的作用。進一步在L-O2-X或HepG2-X細胞中干擾HULC，發(fā)現(xiàn)si-HULC可上調(diào)p18的表達水平，提示HBx通過上調(diào)HULC進而下調(diào)p18的表達。MTT檢測結(jié)果顯示，si-HULC可阻斷HBx促進肝癌細胞增殖的能力，而且