以Ad41為載體的輪狀病毒疫苗免疫效果初探.pdf

1、A組輪狀病毒（GroupARotavirus，簡稱ARV）是引起全世界5歲以下嬰幼兒嚴重腹瀉的首要病原，全世界每年有超過527，000個因感染輪狀病毒而死亡的病例，且每年有近兩百萬以上兒童因此患重病。鑒于輪狀病毒危害嚴重且無有效治療手段，世界衛(wèi)生組織一直將發(fā)展輪狀病毒疫苗列為最優(yōu)發(fā)展疫苗項目之一。
　　 接種RV疫苗被認為是減少重癥RV感染、發(fā)病和死亡的最好方法，目前公認的最佳免疫方式為口服免疫。腺病毒載體是目前基因治療和重組疫

2、苗中應用最廣泛的病毒載體之一。由于腺病毒能在呼吸道和腸道內繁殖，所以能誘導全身免疫并產生局部粘膜免疫。另外，腺病毒安全可靠，可以通過口服或滴鼻給藥，不產生熱源及其它副作用，適于嬰幼兒使用。我們課題組前期以腺病毒為載體表達輪狀病毒保護性抗原，對輪狀病毒基因工程疫苗做了很多系統(tǒng)性的研究工作。我們研究表明，以Ad5為載體，表達輪狀病毒VP6基因的重組腺病毒在滴鼻的免疫方式上，取得了比較好的免疫和保護效果。腸腺病毒HAdV-41是天然的人胃腸道

3、病原，是潛在的口服給藥基因轉移載體和靶向治療胃腸道載體，已有使用HAdV-41作為疫苗載體的相關報道。我們課題組前期已經成功構建了新型的E1區(qū)缺失的重組Ad41載體系統(tǒng)和能夠促進HAdV-41在體外培養(yǎng)和擴增的細胞系293TE7，體外檢測顯示Ad41對酸的耐受情況好于Ad5。另外，口服給藥是最簡單的給藥方式，與腹瀉病毒天然的侵入方式相同，又有同時激活系統(tǒng)免疫和粘膜免疫的作用。因此，以Ad41為載體，探討口服免疫重組輪狀病毒疫苗的免疫保護

4、作用具有重要的意義。
　　 基于前期的研究成果，在本研究中，我們利用反向遺傳學的方法成功構建了HAdV-41感染性克隆pKAd41，建立了293TE7-HAdV-41系統(tǒng)，為進一步開展HAdV-41的生物學研究打下了基礎，為促進Ad41作為口服疫苗載體的研究打下基礎。本研究還成功制備了以Ad41為載體，穩(wěn)定表達人輪狀病毒VP6基因的非復制型重組腺病毒rvAd41-VP6(o)，口服免疫小鼠結果證實，腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載

5、體，比Ad5更適合用于為腹瀉病毒的疫苗研制，為Ad41作為口服疫苗載體的應用提供了有利證據。
　　 一、人腺病毒41型感染性克隆的成功構建
　　 目的:構建人腺病毒41型感染性克隆，以便進一步研究HAdV-41并改良Ad41載體系統(tǒng)。方法和結果:首先，我們用BglⅡ酶切攜帶GFP基因的重組腺病毒質粒pAd41-GFP，回收含有Kan-pBR322Ori和HAdV-41基因組左、右末端的片段，與野生型HAdV-41基因組D

6、NA共電轉化大腸桿菌BJ5183菌株發(fā)生同源重組，經Kan抗性篩選得到HAdV-41感染性克隆pKAd41，該克隆轉染293TE7細胞成功拯救出野生型HAdV-41病毒;通過酶切和測序等方法鑒定拯救的HAdV-41病毒成功整合了穩(wěn)定的基因組DNA;用Westernblot技術驗證了HAdV41病毒含長短Fiber為41型腺病毒;銀染實驗從蛋白水平證實HAdV-41具有比較完整的病毒蛋白組分;分別用HAdV-41病毒感染293TE7和29

7、3細胞，免疫熒光技術檢測發(fā)現Hexon蛋白在293TE7細胞中的表達更強;HAdV-41病毒在293TE7細胞中的生長曲線分析表明，HAdV-41病毒在293TE7細胞中具有非細胞溶解復制特性，并且只有非常少的子代病毒釋放到培養(yǎng)上清中;我們分別以不同MOI的HAdV-41感染293TE7細胞，觀察細胞在感染病毒后連續(xù)1～13d的變化，結果證實病毒感染細胞后在長時間的復制增殖過程中不會有噬斑的出現。結論:本部分研究成功構建了有效的感染性克

8、隆pKAd41，表明用pKAd41和293TE7細胞系統(tǒng)來研究HAdV-41是可取的，為深入研究HAdV-41的生物學特性打下了基礎，為第二部分利用Ad41作為口服疫苗基因轉移載體的研究提供了有用信息。
　　 二、以Ad41為載體的輪狀病毒VP6基因重組腺病毒免疫效果初探
　　 目的:以Ad41為載體，制備和鑒定可表達A組輪狀病毒VP6基因的非復制型重組腺病毒，在小鼠模型上觀察粘膜、體液和細胞免疫效果和攻毒保護作用，探討

9、腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體，用于腹瀉病毒的疫苗研制的可行性。方法和結果:我們首先利用本室前期構建的重組腺病毒真核表達載體，PmeⅠ線性化后經脂質體介導轉染293TE7細胞，包裝出重組腺病毒rvAd41-VP6(o);經酶切和透射電子顯微鏡技術鑒定正確后，通過PCR、RT-PCR技術證實rvAd41-VP6(o)中確有特異性的VP6基因穩(wěn)定整合并轉錄，有較好的遺傳穩(wěn)定性;通過Westernblot技術鑒定目的蛋白的表達和病毒型特異性

10、，結果證實rvAd41-VP6(o)為41型腺病毒，可穩(wěn)定表達VP6蛋白;大量擴增rvAd41-VP6(o)并經氯化銫密度梯度離心純化得到足量的重組腺病毒;用消化法和有限稀釋法檢測滴度，顆粒滴度和感染滴度分別達到了4.35×1011VP/ml和3.95×108IU/ml;一步法生長曲線實驗證實了rvAd41-VP6(o)具備病毒復制生長的基本特征，病毒在細胞中具有非細胞溶解特性;我們在前期實驗中體外檢測證實了Ad41對酸的耐受情況好于A

11、d5;隨后我們進行動物免疫實驗，設rvAd41-VP6(o)、rvAd5-VP6(o)、PBS三組分別以1×1010VP口服免疫小鼠，在同樣的免疫劑量下，三次免疫后，ELISA檢測顯示rvAd41-VP6(o)組產生的血清IgG抗體從陽轉比例(100％，10/10)到抗體強度（OD值1.0300±0.1984）均強于Ad5組（30％，3/10;0.3428±0.2760），引發(fā)了更強的體液免疫，攻毒后對小鼠的保護作用也優(yōu)于Ad5。rvA

12、d41-VP6(o)組的小腸IgA抗體水平強于rvAd5-VP6(o)，誘導了更強的粘膜免疫反應。但是，ELISpot和CBA檢測細胞免疫水平沒有得到有統(tǒng)計學意義的結果。結論:我們成功制備了以Ad41為載體的穩(wěn)定表達VP6基因的重組腺病毒rvAd41-VP6(o)，其在體外具有良好的生物學性質;動物免疫結果提示，腸腺病毒載體Ad41作為疫苗載體，比Ad5更適合用于腹瀉病毒的疫苗研制。
　　 綜上所述，本研究成功構建了人腺病毒HA