硫化葉菌啟動子Initiator元件功能研究.pdf

1、在真核生物中Initiator(Inr)對啟動子活性的重要性已經建立，且屬性研究的比較完善，它是位于轉錄起始位點區(qū)域的一個單向核心啟動子元件，在含有TATA-box的啟動子中鞏固啟動子強度，而在不含有TATA-box的啟動子中定位轉錄起始位點和轉錄方向。然而古菌的研究起步較晚，遺傳體系和遺傳操作并不如真核細胞發(fā)展的成熟，過去在古菌的TATA和Inr之間插入或刪除DNA序列，轉錄起始仍能有效進行，因此人們認為Inr在古菌中并不重要。僅有的

2、兩篇古菌Inr的報導只顯示轉錄起始位點區(qū)域的突變會降低啟動子強度并影響轉錄起始位點的選擇，目前古菌Inr的具體屬性并沒有被深入研究，比如Inr的位置、長度、序列偏好性、保守性。
　　古菌是真核生物在DNA復制、修復、轉錄和翻譯方面的簡化版，故人們研究古菌不僅更了解其本身，也為了解真核細胞提供了模型和進化上的參考。Kimberly B.Decker和Deborah M.Hinton發(fā)現(xiàn)細菌、古菌和真核生物的RNA合成中心在結構和功能

3、上相似，啟動子模塊從細菌到人類普遍保守，細菌、古菌和真核生物在核心啟動子內和靠近核心啟動子區(qū)域的調控策略相似，都會采取不同的核心啟動子元件的組合。真核Inr是啟動子結構多樣性貢獻于轉錄調控多樣性的代表性元件，本文對古菌Inr的研究不僅有助于了解古菌啟動子結構和轉錄起始機制，也將對古菌核心啟動子水平的轉錄調控有更深入的認識。
　　得益于本課題組近年發(fā)展起來的Sulfolobus遺傳操作體系，包括有效的pyrEF營養(yǎng)缺陷型篩選和基于l

4、acS的顏色篩選，以及E.coli-Sulfolobus穿梭質粒pZC1，我們可以用重疊延伸PCR和反向PCR構建多種Inr突變啟動子，將這些Inr突變啟動子和報告基因lacS融合插入pZC1，以Sulfolobus islandicus E233S pyrEF/lacS雙突變菌株作為宿主，得到相應的轉化子。比較各個轉化子的lacS比活性，根據lacS酶活性的變化確定突變對表達的影響，并采用RT-qPCR和引物延伸實驗確定突變對轉錄的影

5、響，然后計算翻譯水平的影響。
　　硫化葉菌阿拉伯糖操縱子有4個基因araS(Arabinose binding protein)，araT和araU(Permease)還有araV(ATPase)，本課題組對araS啟動子的研究有一定的基礎，araS Inr成為我們的首要研究對象，啟動子+1到+6突變對酶活有劇烈影響支持了此處含有Inr的假設，進一步的引物延伸和RT-qPCR證實這是一個影響轉錄的元件，而對翻譯的影響有限。在無ar

6、a-box的啟動子T6BRE的基礎上突變Inr，酶活下降為D-55的2.1％，基本失去活性，這說明Inr并不止在受誘導的araS啟動子中才起作用，而是基礎啟動子發(fā)揮活性所必須的基本啟動子元件。在T6BRE的基礎上突變TATA-box，酶活完全喪失，說明Inr對啟動子的貢獻依賴于TATA-box。araS Inr的系統(tǒng)突變發(fā)現(xiàn)在araS啟動子中天然Inr功能最強，序列偏好性可以總結為+1GAKAMY+6(IUPAC，K=G或T;M=A或C

7、;Y=T或C)，這可以幫助我們鑒別潛在的Inr和轉錄起始位點，也是尋找Inr結合蛋白的必要信息。
　　另一方面生物信息學方法被用來分析S.solfataricus P2487個基因的保守Inr序列，配合體內實驗得到的堿基偏好性對比分析。S.solfataricus P2生物信息學比對得出的-1YRWKAAA+6的保守序列與araS Inr非常相似，分類比對發(fā)現(xiàn)Inr傾向存在于UTR≥4的基因中，不同功能基因的比對發(fā)現(xiàn)Inr在能量代

8、謝基因中非常保守。序列比對證明不是所有基因都含有Inr，這和S.islandicus中體內實驗結果相對應，同樣受阿拉伯糖調控的SiRe0562、SiRe2130、SiRe2129和SiRe2125并不含有Inr。但突變含有Inr的基因，不論是araS還是隨機選擇的Sso1934、Sso3180和Sso1171，酶活都顯著降低。
　　把araS Inr插入無Inr基因SiRe0562、sso0009和sso1029的啟動子中，它們的

9、表達得到了增強。細胞對有和沒有Inr的基因進行差異調控，這可能基于TFB和RNA聚合酶與Inr的結合，這種機制與σ家族介導的細菌轉錄調控和Halophile中GTFs組合參與的全局調控相似。Sulfolobus只編碼一個TBP和兩個有功能的TFBs，TFB或RNA聚合酶與Inr親和度的差異正好可以彌補有限的GTFs，增加轉錄調控的可能。
　　總的來說，本研究通過體內實驗和生物信息學分析鑒定到古菌中保守的Inr,發(fā)現(xiàn)Inr對轉錄很重