黑曲霉胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、β-葡萄糖苷酶是纖維素酶中重要的組成成分，能夠?qū)⒗w維二糖水解成葡萄糖。而纖維二糖的積累會對內(nèi)切β-葡聚糖苷酶和外切β-葡聚糖苷酶產(chǎn)生明顯的抑制作用，β-葡萄糖苷酶能夠緩解這種抑制作用，所以β-葡萄糖苷酶是纖維素降解過程中的關(guān)鍵酶、限速酶。但是β-葡萄糖苷酶的水解產(chǎn)物葡萄糖，又會對β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生明顯的產(chǎn)物抑制作用。所以發(fā)現(xiàn)一種能夠耐受葡萄糖抑制的β-葡萄糖苷酶是以后的研究方向。
　　黑曲霉在酶制劑方面有著重要的應(yīng)用，有著高效的蛋

2、白分泌系統(tǒng)。黑曲霉也是β-葡萄糖苷酶的高產(chǎn)菌株，能夠產(chǎn)生大量的胞外β-葡萄糖苷酶，隨著工業(yè)酶生產(chǎn)菌株CBS513.88和檸檬酸生產(chǎn)菌株ATCC1015測序工作的完成，我們將預(yù)測的β-葡萄糖苷酶基因挑選出來，通過對信號肽的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)黑曲霉含有大量的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶基因，根據(jù)葡萄糖的運輸機制，推測胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的耐受葡萄糖的能力可能要優(yōu)于胞外基因。為了驗證我們的想法，研究了黑曲霉部分胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的性質(zhì)，結(jié)果如下：
　　⑴根

3、據(jù)公布的黑曲霉基因組數(shù)據(jù)顯示，預(yù)測含有15型β-葡萄糖苷酶，其中3型屬于GH1家族，12型屬于GH3家族。依據(jù)信號肽的有無，預(yù)測含有6型胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶，GH1含有1型，GH3含有5型。
　?、埔喳熎?、麥秸桿、甘蔗渣（SEB）、纖維二糖、木糖、蔗糖為底物時，胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性存在較大差異，其中能夠誘導(dǎo)出較高活性的底物有麩皮、麥秸桿、甘蔗渣（SEB），而且酶活性隨著誘導(dǎo)時間的延長而增加。以木糖和蔗糖為底物時，胞內(nèi)β-葡萄糖苷

4、酶的活性很弱。以纖維二糖為底物時，酶活性不如自然底物時誘導(dǎo)的明顯，但明顯比木糖的誘導(dǎo)能力突出。
　　⑶對于用以上六種碳源進行誘導(dǎo)時，GH1的表達量始終是最高的，GH3-12的表達量最低。GH1和GH3-12的表達模式非常相近，都能夠快速的響應(yīng)麥秸桿，且以纖維二糖為底物時，表達水平隨著時間的延長表達量降低。其余四種β-葡萄糖苷酶的表達很相近。
　　⑷在擴增GH1家族的基因時，出現(xiàn)了兩種不同的轉(zhuǎn)化子，其中一個比正?；蛉笔?2b

5、p，而且不是隨機出現(xiàn)的情況，比例約占1/3，通過同源比對，這72bp結(jié)構(gòu)為蛋白外層的兩個α-螺旋之間的連接結(jié)構(gòu)，功能未知。將胞內(nèi)bgl在原核中表達，可以得到大量表達，但大部分是以包涵體的形式存在，通過把誘導(dǎo)物IPTG和降低溫度相結(jié)合的方法，上清中獲得了少量可溶性蛋白，即使有可溶性蛋白，也是沒有活性的蛋白
　　⑸在畢赤酵母中進行分泌表達，在上清中不能發(fā)現(xiàn)目的條帶，但是可以測量到相應(yīng)的酶活，通過粗酶對pNPG的活性來研究胞內(nèi)BG的酶學(xué)

6、性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)最適pH在6.6附近，偏中性，最適溫度在50℃，在55℃時基本沒有活性。通過HPLC對產(chǎn)物的分析發(fā)現(xiàn)，對纖維二糖水解活性最明顯的是GH1-4。GH1-4和GH1-7相比，對纖維二糖的水解活性下降非常明顯。粗酶液對纖維二糖反應(yīng)時沒有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)糖苷的活性。
　?、试诋叧嘟湍赴麅?nèi)表達黑曲霉胞內(nèi)BG，玻璃微珠破碎，經(jīng)過Ni+初步純化之后，能夠看到微弱的條帶，與分泌表達相比，酶活大幅度提高。以pNPG為底物時GH1-4，GH1-7，

7、GH3-12純酶的最適pH在6.6-7.0，pH在4.6時基本喪失活性，最適溫度都在50℃。胞內(nèi)BG對pH不敏感，在最適pH的半衰期將近300min，但是胞內(nèi)BG對溫度比較敏感，而且GH1-7對溫度非常敏感，半衰期只有60min，其余半衰期210min。以pNPG為底物時，GH1-4，GH1-7，GH3-12的Km分別為0.277、0.434、0.361mM，對pNPG的親和性GH1-4要高于GH1-7和GH3-12，葡萄糖對GH1-4