利用重組大腸桿菌進行高分子量蜘蛛牽引絲蛋白2高效生產(chǎn)的研究.pdf

1、蜘蛛牽引絲由大壺狀腺分泌形成，擁有卓越的力學性能；是一種在工業(yè)及生物醫(yī)藥方面極具應用前景的生物材料。天然蜘蛛牽引絲主要由兩種高分子量蛋白構成，蜘蛛牽引絲蛋白1和2（major ampullate spidroin1 and2），文獻信息表明前者對蜘蛛牽引絲的剛性性能起重要作用，后者主要負責彈性性能。由于蜘蛛攻擊性強的天性，通過大規(guī)模養(yǎng)殖技術很難獲得大量蜘蛛牽引絲。隨著合成生物學技術的發(fā)展，異源生產(chǎn)蜘蛛牽引絲蛋白的方式受到越來越多研究者的

2、關注。但是由于該蛋白分子量大、序列高度重復且甘氨酸含量高的特點，目前其產(chǎn)量普遍較低；并且關于蜘蛛牽引絲蛋白2的表達研究較少。本文根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性對蜘蛛牽引絲蛋白2的核心重復片段進行基因設計，并在大腸桿菌中實現(xiàn)了不同分子量重組蜘蛛牽引絲蛋白2的表達載體構建和表達。通過將蛋白誘導溫度由30℃降低到16℃，顯著提高了分子量從28.3-256.5 kDa的重組蜘蛛牽引絲蛋白2的表達水平；而改變誘導劑濃度、誘導時機和培養(yǎng)基成分并沒有顯著提

3、高該蛋白的表達量。通過對蛋白表達過程中質粒的維持性進行研究，發(fā)現(xiàn)可能是由于低溫誘導條件下重組菌的質粒維持性提高使得目標蛋白的表達水平得到了顯著提升。低溫誘導策略對于高分子量蜘蛛牽引絲蛋白1表達水平的提高也有顯著效果。實驗中以代謝改造工程菌（含有能夠提高胞內glycyl-tRNA含量的質粒）為宿主細胞進行低溫誘導表達，進一步提高了分子量為201.6 kDa重組蜘蛛牽引絲蛋白2的產(chǎn)量。隨后在3.0 L反應器中將低溫誘導策略與高密度發(fā)酵技術相