達氏鰉熱休克蛋白70和90基因的克隆及其對溫鹽脅迫的響應.pdf

1、分類號分類號密級密級UDC編號編號碩士學位論文達氏鰉熱休克蛋白70和90基因的克隆及其對溫鹽脅迫的響應彭國干(1261003)指導教師姓名趙文教授專業(yè)名稱生態(tài)學論文答辯日期2015年5月25日學位授予日期2015年6月摘要I摘要達氏鰉自然種群是生活于我國黑龍江及其流域的冷水性淡水魚，屬于鱘科魚類，其個體大，抗病力強，性成熟晚，養(yǎng)殖目的主要是獲取魚子醬。目前，達氏鰉養(yǎng)殖群體已從寒冷的黑龍江南移至北京、河北、湖北、四川、重慶、云南等地，養(yǎng)殖

2、溫度逐漸升高，運輸頻率逐漸變大，達氏鰉面臨著越來越嚴峻的生存考驗。熱休克蛋白（HSP）是生物體中重要的應激蛋白，它對保持機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面有突出的作用。本文的主要目的是研究熱休克蛋白在幫助達氏鰉應對嚴峻環(huán)境挑戰(zhàn)時做出的調控方式，以期為達氏鰉在養(yǎng)殖和運輸方面提供理論支持，旨在為保護達氏鰉人工種群提供理論依據(jù)。本文采用同源克隆法和末端快速擴增（RACE）技術克隆了達氏鰉HSP70和HSP90基因全長序列，并設計5個溫度梯度（4℃、10℃、1

3、6℃、25℃、28℃）和5個鹽度梯度（0ppt、10ppt、20ppt、30ppt、40ppt）的條件對達氏鰉進行處理，以溫度16℃鹽度0ppt作為對照，做組織表達差異分析，同時取肌肉、鰓絲和肝臟作為樣品做熒光定量分析。試驗結果得出，達氏鰉HSP70基因（Genbank登錄號：KP050541）序列全長為2275bp，包括5′非編碼區(qū)85個核苷酸，3′非編碼區(qū)237個核苷酸和開放閱讀框（F）1953個核苷酸。通過分析氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，達氏

4、鰉HSP70基因編碼氨基酸650個，分子量71.13KD，理論等電點5.215，含有HSP70家族的3個標簽序列，分別位于氨基酸序列的9－16（IDLGTTYS），197－210（IFDLGGGTFDVSIL）和334－348（IVLVGGSTRIPKIQK）上。達氏鰉HSP90基因（Genbank登錄號：KP050542）序列全長2718bp，包括5′非編碼區(qū)44bp，3′非編碼區(qū)497bp和開放閱讀框（F）2178bp。通過分析氨基

5、酸序列發(fā)現(xiàn)，達氏鰉HSP90編碼725個氨基酸，分子量83.62KD，其理論等電點4.846。該蛋白含有HSP90家族的1個標簽序列，位于氨基酸序列的32－41（YSNKEIFLRE）上。達氏鰉熱休克蛋白組織表達分析顯示，HSP70和HSP90在達氏鰉的11種組織中都有表達，包括肌肉、鰓絲、腦、須、心臟、肝臟、脾臟、胃、腸道、鰾和性腺，其中兩個基因在腸道中的表達量均最高，在肌肉中的表達量均最低，同時我們發(fā)現(xiàn)HSP70和HSP90在各組織

6、間的表達趨勢是一致的。溫度脅迫表達分析結果顯示，4℃處理下在肌肉，鰓絲和肝臟中達氏鰉HSP70和HSP90的表達量均是最高；相對于高溫脅迫（25℃、28℃），達氏鰉HSP70和HSP90對低溫脅迫（4℃、10℃）更敏感。鹽度脅迫表達分析結果顯示，各鹽度脅迫下，達氏鰉HSP70和HSP90基因表達量變化不大。本研究結果分析表明，達氏鰉熱休克蛋白在4℃情況下高表達，說明HSP70和HSP90基因在伴隨達氏鰉度過嚴寒的環(huán)境發(fā)揮了非常重要的作用