萊茵衣藻IFT46的原核表達純化及其多克隆抗體的制備.pdf

1、萊茵衣藻是具有兩條等長纖毛的一種單細胞真核藻類，是研究纖毛的組裝、解聚與功能的模式生物。纖毛是一種細胞天線，負責胞外信息向胞內的傳遞，其組裝與維持依靠纖毛內運輸(IFT)機制。纖毛在結構或功能上的缺陷會導致在人體統(tǒng)稱為“纖毛病”的遺傳性疾病，如肥胖癥、糖尿病、先天性心臟病、多囊腎病等。然而，目前人們對調控纖毛內運送的機制知之甚少。
　　纖毛內運送蛋白IFT46是IFT復合物B的一個重要組分，它在不同的物種中都是高度保守的，且在纖毛

2、內運輸、纖毛的組裝與解聚中均發(fā)揮著重要作用。為深入研究其功能，蛋白質水平和分子水平上的研究是必需的，因此本實驗通過制各高效價和高特異性的IFT46抗體為后續(xù)研究奠定基礎。
　　本研究利用ift46基因全序列分別構建了帶有GST和MBP標簽的原核表達載體pGEX-2T-IFT46和pMAL-c2X-IFT46，通過轉化大腸桿菌BL21(DE3)菌株并用IPTG誘導表達，以15％ SDS-PAGE鑒定，分別獲得分子量為70、86 kD

3、a的表達ITF46的重組蛋白。將純化的GST-IFT46融合蛋白（純度95％以上）免疫新西蘭大白兔，采集第5次免疫后血液并分離血清進行抗體純化及活性鑒定。間接ELISA測定結果表明抗血清效價大于1∶256000，進一步將抗血清依次經(jīng)過Protein A、MBP-IFT46和硝酸纖維素膜三步親和純化，獲得了高特異性和靈敏度的多克隆抗體。用Western blotting和免疫熒光法檢測結果顯示，制備的多克隆抗體能夠很好的識別萊茵衣藻中IF