豬卵胞質(zhì)注射及單精子胞質(zhì)內(nèi)注射介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法研究.pdf

1、本研究在優(yōu)化豬卵母細(xì)胞體外成熟、激活及胚胎培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)探討了體外受精及孤雌激活胚胎CI-MGT和ICSI-MGT的相關(guān)影響因素，并對(duì)CI-MGT體外受精胚胎及ICSI-MGT胚胎生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因豬可行性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果如下:
　　1.探討了成熟液和胚胎培養(yǎng)液組分對(duì)豬卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育效果的影響。結(jié)果顯示，成熟基礎(chǔ)液為TCM-199核成熟率和胚胎發(fā)育效率顯著高于NCSU-37和PZM-3(P＜0.05)。以TCM-199

2、為成熟基礎(chǔ)液，不加額外能量底物(PMt)的核成熟率和孤雌囊胚發(fā)育率分別為74.1±2.4％和29.3±1.3％，顯著高于添加0.91 mmol/L丙酮酸鈉+3.05 mmol/L葡萄糖(PMtsg)或0.91 mmol/L丙酮酸鈉+3.05 mmol/L葡萄糖+0.1 mg/mL谷氨酰胺(PMtsgg，P＜0.05)。在成熟液中添加10 IU/mL eCG+15 IU/mL hCG組的核成熟率和胚胎發(fā)育效率顯著高于添加0.5μg/mL

3、FSH+0.5μg/mL LH或0.5μg/mL FSH+10 UI/mL hCG。成熟液中添加50 ng/mL EGF+10 ng/mL IGF-I組囊胚率顯著高于添加10 ng/mL EGF和不添加組(P＜0.05)。對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟過程中核相變化研究顯示，成熟培養(yǎng)38 h的核成熟率為57％(105/184),40 h為43％(82/189),42 h為48％(75/155),44 h為59％(208/354),46 h為70％

4、(59/84),48 h為62％(51/82),50 h為74％(154/207)。
　　在以PZM-3為基礎(chǔ)液的胚胎培養(yǎng)液中添加0.277 mmol/L肌醇(PZMi)，其囊胚率顯著高于添加0.34 mmol/L檸檬酸鈉(PZMc)或0.34mmol/L檸檬酸鈉+0.277 mmol/L肌醇(PZMci，P＜0.05);添加0.5 mg/mL透明質(zhì)酸組的囊胚率顯著高于未添加組（P＜0.05）;添加3 mg/mLBSA-FAF組的

5、囊胚率顯著高于添加BSA-V組（41.4±4.1％ vs36.7±3.8％，P＜0.05）。培養(yǎng)液中BSA濃度增加至5 mg/mL或在培養(yǎng)96 h后加入10％ FBS的囊胚率和囊胚孵化率均有所增加，但差異不顯著。添加50 ng/mL IGF-I的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)高于未添加組，但差異不顯著。
　　2.探討了激活方法對(duì)豬卵母細(xì)胞孤雌胚胎發(fā)育效果的影響。結(jié)果顯示，卵母細(xì)胞經(jīng)5μmol/L離子霉素(Ion)激活5 min后，再分別在含2

6、mmol/L6-二甲基氨基嘌呤（6-DMAP），5μg/mL細(xì)胞松弛素B(CB)+10μg/mL放線菌酮(CHX)，5μg/mL CB+2 mmol/L6-DMAP，5μg/mL CB+10μg/mLCHX+2 mmol/L6-DMAP培養(yǎng)4h的囊胚率顯著高于在10μg/mL CHX培養(yǎng)4h的囊胚率（29.7±1.1％、29.8±1.2％、30.4±1.6％和30.2±2.7％ vs15.8±1.5％，P＜0.05），但四組間囊胚率、I

7、CM細(xì)胞數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)及ICM/TE均無顯著差異。當(dāng)電脈電壓為1.25 KV/cm時(shí)3次電脈沖電激活的囊胚發(fā)育率顯著高于2次電脈沖(P＜0.05)，當(dāng)電脈沖為3次時(shí)電場強(qiáng)度為0.80和1.00 KV/cm的胚胎碎裂率顯著低于1.20 KV/cm，且1.00 KV/cm組的囊胚率顯著高于0.80和1.20 KV/cm組(P＜0.05)。卵母細(xì)胞電激活后分別用5μg/mL CB+10μg/mL CHX，5μg/mL CB+2 mmol/L6

8、-DMAP培養(yǎng)處理4h的囊胚率（55.4±1.2％和50.4±2.9％）顯著高于用2 mmol/L6-DMAP（37.9±2.4％），5μg/mL CB+10μg/mL CHX+2 mmol/L6-DMAP（36.9±3.1％）培養(yǎng)處理4h的囊胚發(fā)育率，亦顯著高于單純電激活處理（40.7±1.7％）和Ion激活后用2 mmol/L6-DMAP（30.6±0.8％）培養(yǎng)處理4h的囊胚發(fā)育率(P＜0.05)。電激活后，用5μg/mL CB培

9、養(yǎng)處理4h的囊胚率顯著高于用10μg/mL CB培養(yǎng)處理4h(54.0±4.1％ vs37.9±2.4％，P＜0.05)，與7.5μg/mL CB組差異不顯著，但7.5μg/mL CB組的ICM細(xì)胞數(shù)和ICM/TE均顯著高于5μg/mL CB組(P＜0.05)。對(duì)胚胎核型進(jìn)行分析結(jié)果表明，電激活后用7.5μg/mL CB+10μg/mL CHX培養(yǎng)處理4h的囊胚細(xì)胞二倍體率顯著高于單純電激活處理組(84.6％ vs40.0％,P＜0.0

10、5)。
　　3.研究了豬卵胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因的影響因素。孤雌激活卵胞質(zhì)注射(PA-CI)的研究結(jié)果顯示，注射外源RNA、外源RNA+1-4 U/μL RNA酶抑制劑對(duì)孤雌激活卵的囊胚率、ICM細(xì)胞數(shù)、TE細(xì)胞數(shù)及ICM/TE均無顯著影響，表明可同時(shí)注射外源RNA和RNA酶抑制劑。注射100 ng/μLEGFP-N1 DNA的孤雌囊胚陽性率顯著高于50 ng/μL和空注組，但囊胚率顯著低于其余兩組(33.9±1.1％ vs46.4±2

11、.1％和50.5±1.9％，P＜0.05);注射100ng/μL Talen-BMP15 RNA的囊胚率與50 ng/μL注射組和空注組差異不顯著，表明注射DNA對(duì)胚胎毒性大于注射RNA。孤雌激活后5-18 h注射的囊胚率均顯著低于注射后立刻激活或激活后立刻注射的囊胚率(P＜0.05)。注射EGFP-N1線性化DNA的囊胚陽性率顯著高于環(huán)狀DNA（15.8±1.4％ vs11.7±1.0％，P＜0.05），但兩者胚胎發(fā)育率差異不顯著，并

12、且外源RNA注射組的囊胚率普遍高于注射DNA載體。當(dāng)采用體外受精卵進(jìn)行胞質(zhì)內(nèi)注射時(shí)(IVF-CI)，精卵孵育后5-18 h注射線性化EGFP-N1載體的囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)差異均不顯著，但5-6、8-9和11-12 h注射組胚胎陽性率顯著高于14-15和17-18 h(12.6±0.6％,11.8±0.5％和13.6±0.6％ vs8.7±0.8％和6.5±1.0％，P＜0.05)，表明外源DNA在豬雌雄原核形成期（約13 h）前注射的外

13、源基因整合效率較高。注射40和50 ng/μL EGFP-N1 DNA組囊胚率顯著高于100 ng/μL，與10、20、30 ng/μL和空注組差異不顯著，同時(shí)40、50和100 ng/μL組陽性率顯著高于其余各組（P＜0.05）。IVF卵注射GDF8Cas9 mRNA/sgRNA的囊胚率顯著低于PA卵(13.7±0.8％ vs52.6±3.1％，P＜0.05)，但注射IVF卵的胚胎基因突變效率顯著高于注射PA卵(25.0％ vs3.8

14、％，P＜0.05)，表明Cas9/sgRNA系統(tǒng)可以通過注射豬IVF卵對(duì)豬的基因組進(jìn)行編輯。
　　4.系統(tǒng)研究了豬單精子胞質(zhì)內(nèi)注射轉(zhuǎn)基因的影響因素。結(jié)果顯示，精子與外源基因孵育5、30和60 min囊胚率顯著高于孵育24 h，但30和60 min組陽性率和囊胚陽性率顯著高于5 min(P＜0.05)。采用不同冷凍液(DPBS、BTS和mNIM)冷凍精子對(duì)ICSI-MGT胚胎發(fā)育率無顯著影響，但精子孵育液DPBS+EDTA(10 m

15、mol/L EDTA)的囊胚率顯著高于DPBS組的囊胚率顯著高于DPBS+EDTA組，表明孵育液中的EDTA和K+對(duì)注射后的胚胎發(fā)育有影響。卵母細(xì)胞激活后注射超聲+凍融和NaOH處理精子的囊胚率顯著高于激活前注射組(35.7±2.4％ vs30.2±0.6％;34.5±0.3％ vs28.5±0.9％，P＜0.05)，表明精子破膜與激活影響ICSI-MGT胚胎的發(fā)育。卵母細(xì)胞激活后0-30 min注射的囊胚率顯著低于60-90 min注

16、射組，但陽性率和囊胚陽性率均顯著高于60-90 min注射組。對(duì)ICSI后不同時(shí)間合子內(nèi)的GSH含量分析顯示，激活后0-30 min注射組的6h合子GSH含量顯著低于60-90 min注射組和孤雌激活組(3.22±0.06 vs5.02±0.09和4.73±0.14，P＜0.05)，而60-90 min注射組的6h和12 h合子GSH含量與孤雌組均無顯著差異。進(jìn)一步原核分析發(fā)現(xiàn)，0-30 min注射組的雌雄雙原核形成率顯著高于60-90

17、 min（56.9±3.7％ vs36.3±2.0％，P＜0.05），且0-30min注射組精子解聚率顯著高于60-90min，表明延長激活以后的注射時(shí)間會(huì)造成更高的孤雌胚胎產(chǎn)生。采用不同外源基因載體(EGFP-N1、Anti-FMDV、PRL-EGFP和IFN-EGFP)的ICSI-MGT囊胚率差異不顯著，但顯著影響胚胎陽性率，其中EGFP-N1線性化載體陽性率顯著高于環(huán)狀載體(35.9±0.2％ vs20.9±0.9％，P＜0.05