MiR-144靶向調(diào)控meis1表達在斑馬魚胚胎期造血及血管發(fā)育中的功能研究.pdf

1、目前，血液病與心血管疾病已是危害人類健康的重大問題，給國民經(jīng)濟帶來不可估量的損失。我國至少有400萬白血病患者，每年新增約4萬名白血病患者，其中50％是兒童。心血管病患者人數(shù)約為2.3億，相當于每10個成年人中有2人患有心血管疾病。因此，揭示造血及心血管發(fā)育的分子機制及其相關(guān)疾病的發(fā)病的機理，建立新的防治策略和治療方案是醫(yī)學和生命科學領(lǐng)域急需解決的重大基礎(chǔ)科學問題。目前，研究者面臨的最大挑戰(zhàn)就是尋找更多造血及心血管發(fā)育具有調(diào)控功能的治療

2、靶分子和信號途徑。
　　MicroRNA(miRNA)是近年發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源的、長度約22個核苷酸的非編碼微小RNA，廣泛存在于真核生物中，具有多種重要的調(diào)節(jié)作用。miR-144是在造血組織及血液中特異表達的一個miRNA，已報道m(xù)iR-144在白血病患者表達顯著降低，并且在腫瘤發(fā)生、血紅蛋白合成中發(fā)揮重要作用。但miR-144在造血與血管發(fā)育中的功能作用仍不清楚。本研究以模式生物斑馬魚為研究對象，采用生物信息學預(yù)測分析方法、顯微注

3、射、整體原位雜交以及拯救實驗技術(shù)，揭示miR-144在斑馬魚胚胎造血及血管發(fā)育過程的生物學功能，闡明miR-144介導(dǎo)的血細胞發(fā)育及血管發(fā)育的分子機制。首先，應(yīng)用多個在線生物信息學軟件全面預(yù)測分析miR-144靶向調(diào)控潛在靶標，發(fā)現(xiàn)包括meis1在內(nèi)的三十多個基因可能是miR-144的潛在靶標。通過體內(nèi)外報告基因質(zhì)粒檢測發(fā)現(xiàn)miR-144直接靶向調(diào)控meis1表達。進一步通過顯微注射在斑馬魚胚胎過表達miR-144，發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎MEI

4、S1表達顯著降低。從而說明在斑馬魚胚胎中miR-144通過直接靶向調(diào)控meis1表達(P<0.05)。Meis1是三氨基酸環(huán)延伸家族一員，是同源基因hoxa9和pbx1的輔助因子。已有大量研究表明meis1對內(nèi)皮細胞分化、造血、眼睛發(fā)育等有舉足輕重的作用，并且與白血病發(fā)生相關(guān)。接下來深入探究miR-144介導(dǎo)meis1表達在斑馬魚胚胎造血及血管發(fā)育中的功能作用。
　　其次，應(yīng)用細胞化學染色檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-144阻滯胚胎中包括

5、粒細胞、巨噬細胞在內(nèi)髓系細胞的發(fā)育。經(jīng)整體原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，髓系血細胞發(fā)育的關(guān)鍵基因(scl、gata2和pu.1)和造血干細胞標記基因(c-myb,runx1)表達降低。緊接著通過顯微共注射meis1基因mRNA的拯救實驗發(fā)現(xiàn)回補meis1可明顯恢復(fù)scl、pu.1、c-myb和runx1基因表達，同時回補了胚胎粒細胞、巨噬細胞的生成。從此說明miR-144介導(dǎo)meis1表達調(diào)控斑馬魚胚胎髓細胞發(fā)育。
　　第三，經(jīng)O染色檢測發(fā)現(xiàn)

6、過表達miR-144顯著降低胚胎紅細胞生成，同時經(jīng)原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)紅細胞發(fā)育相關(guān)基因scl、gata1、cmyb以及runx1在高表達miR-144的胚胎中表達式顯著降低，但通過拯救實驗發(fā)現(xiàn)用meis1基因mRNA不能很好恢復(fù)胚胎紅細胞生成，而是采用meis1基因和gata1基因mRNA共同注射才能恢復(fù)胚胎紅細胞生成。綜合相關(guān)文獻，推測miR-144/451基因簇協(xié)調(diào)表達調(diào)控胚胎紅細胞發(fā)育。
　　最后，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因斑馬魚(flk1)

7、研究發(fā)現(xiàn)高表達miR-144顯著影響胚胎內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)育，胚胎節(jié)間血管(ISV)生成嚴重受阻，且在DA區(qū)熒光強度也有所降低。進一步經(jīng)原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)高表達miR-144顯著降低動脈標記基因(ephrinB2)表達，而靜脈發(fā)育標記基因(flt4、ephB4)未見明顯變化。通過拯救實驗發(fā)現(xiàn)meis1基因mRNA可以恢復(fù)胚胎節(jié)間血管(ISV)和動脈發(fā)育。從而說明miR-144介導(dǎo)meis1表達在斑馬魚胚胎血管發(fā)育中有著重要的生物學功能。本研究的完