基于微流控芯片細胞中非穩(wěn)態(tài)物質超氧自由基的分析檢測.pdf

1、細胞是生物體的形態(tài)結構和生命活動的基本單元。在生物體的氧化代謝過程中不斷產生各種活性氧自由基，如：超氧陰離子自由基(O2-)、羥基自由基(HO·)、脂自由基(ROO·)、過氧化氫(H2O2)、單線態(tài)氧(1O2)、過氧亞硝基陰離子(ONOO-)等。研究表明，生物體內活性氧自由基水平直接與生物的生理、病理相關。適當水平的活性氧對維持生物正常的生理過程是重要的；過量自由基的產生并累積則會誘導生物體產生老化及各種疾病。O2-作為其他活性氧的前導

2、物，過量時不僅會對生物體內的許多生物分子造成損傷，而且還能通過其它途徑轉化成毒性更大的HO·、H2O2、1O2等自由基。目前檢測超氧陰離子自由基的方法主要有電子自旋共振法(ESR)、高效液相色譜法(HPLC)、化學發(fā)光法(CL)、熒光法以及電化學方法等。上述方法對生物學中O2-的研究起到了很好的幫助作用。然而，由于細胞尺度小、胞內超氧自由基的半衰期非常短、穩(wěn)態(tài)濃度極低，以及缺少對O2-有效捕獲的探針等因素的制約，使得目前具備高選擇性，高

3、靈敏度和生物實用性的O2-分析檢測方法還是比較少的。一些傳統的分析方法多是將各種活性氧自由基作為一個整體，獲得的結果多是基于靜態(tài)、宏觀的觀察和整體平均而推導出來的。存在取樣體積大、質量檢測限高、分析時間長、儀器價格昂貴等不足。為此，發(fā)展高選擇性、高靈敏度的識別與快速、定量測定超氧陰離子的分析方法對當今自由基生物學研究十分必要。 自20世紀90年代初Manz和Widmer等首次提出以多學科交叉為特征的微全分析系統(miniatur

4、ized total analysis systems，μ-TAS)的概念以來，微流控芯片(microfluidic chip)已成為近年來分析化學、生物化學、醫(yī)學等領域微分析系統研究的重要技術平臺之一。微流控芯片電泳(microfluidic chip based CE，MCE)是在具有微通道網絡結構的芯片上，通過微流體驅動/控制、檢測等技術單元的組合，實現生化樣品的進樣、分離與檢測等功能，具有快速、低耗、高效及多種功能集成等優(yōu)點。微

5、流控芯片電泳用于細胞組分分析已成為近年來各學科交叉研究的熱點。本論文從分子水平上分離、分析檢測O2-出發(fā)，以自行搭建的微流控芯片電泳--激光誘導熒光檢測系統為技術依托，以實驗室設計合成的熒光探針為基礎，對細胞中O2-的檢測方法進行了研究。與傳統的O2-分析檢測方法相比，該檢測方法得到的濃度更逼近了細胞內O2-的真實水平，力圖為具有潛在生物醫(yī)學應用價值的微流控自由基分析檢測奠定基礎。本論文共分三章，概述如下： 第一章，微流控芯片用

6、于細胞組分分析研究的概述。 第二章，選用實驗室合成的2-氯1，3-二苯并噻唑林環(huán)己烷(DBZTC)為熒光標記試劑，以微芯片電泳-激光誘導熒光檢測(MCE-LIFD)為分析技術平臺，建立了一種快速檢測肝癌細胞勻漿中O2-的方法。最佳的電泳條件下，30s內實現了超氧自由基的檢測，得到的線性范圍為4.0×10-7-1.0×10-5M；濃度檢測限(S/N=3)為0.15μM，質量檢測限為0.03fmol(樣品進樣體積為200pL)；峰面

7、積和遷移時間的相對標準偏差(RSDs)分別為2.6％和3.8％。干擾試驗表明，該方法在生物體系中，1000倍過量H2O2不干擾檢測。最后將該方法應用到肝癌細胞和PMA刺激的小鼠巨噬細胞中O2-的檢測，回收率分別為97.3％和98.6％。 第三章，基于第二章已建立的分析體系，進行了微流控芯片上單個肝癌細胞中O2-的分析檢測方法的研究。在完成肝癌細胞培養(yǎng)、確定芯片結構的基礎上，針對細胞的強吸附、無規(guī)律群聚以及芯片內外需要等滲壓的特點