本氏煙轉錄因子ERF和WRKY1的抗疫霉病相關的功能研究.pdf

1、轉錄因子(transcription factor)是一類能夠特異性的與DNA序列結合，從而保證目的基因以特定的強度在特定時間和空間上表達的蛋白質，其主要的功能是激活或抑制下游基因的轉錄。根據轉錄因子保守功能域DNA結合區(qū)(DNA-binding domain，DBD)的不同，可以將其劃分成不同的轉錄因子家族。近年來，對大量的植物轉錄因子研究發(fā)現，有些轉錄因子家族能夠直接或間接的參與植物的防衛(wèi)反應，如MYB家族、bZIP家族、ERF家族

2、和WRKY家族。這些轉錄因子的保守功能域通過與調控基因的啟動子區(qū)相關順式元件的特異性結合，直接調控植物靶標基因的轉錄，或形成同源、異源二聚體，或與其他蛋白質互作形成某種活化形式參與信號轉導途徑，參與植物抗病性相關基因表達的調控網絡。通過基因工程手段過表達植物抗病性相關轉錄因子，調控植物防衛(wèi)反應網絡中多個抗性基因的表達，從而改善植物的綜合抗病能力。因此，抗病相關轉錄因子的研究對植物抗病基因工程具有重要的意義。本文中，初步篩選到與本氏煙（N

3、icotiana benthamiana）植物抗病性相關的轉錄因子ERF和WRKY1，并進一步研究了它們分別調控已知疫霉誘導型啟動子GmaPPO12的活性的情況，為植物抗病基因工程提供可能有價值的抗病相關轉錄因子。
　　本氏煙中抗疫霉病相關轉錄因子ERF和WRKY1的篩選:根據文獻報導，挑選普通煙（Nicotiana tabacum）中受病原菌誘導上調表達的轉錄因子。利用同源比對的方法，在本氏煙基因組中分別尋找30個與其同源的轉錄

4、因子，包括WRKY家族、ERF家族和MYC家族。然后，對在疫霉誘導過程中上調表達的轉錄因子及其家族，進一步利用病毒誘導的基因沉默技術(Virus-induced gene silencing，VIGS)，對轉錄因子進行沉默。通過檢測基因的沉默效率，初步篩選到2個沉默效率超過50％的轉錄因子基因。
　　進一步分別在沉默轉錄因子的本氏煙上，用辣椒疫霉P.capsici游動孢子接種，在接種后0h、12h、24 h和36h，在手持紫外燈下

5、觀察細胞死亡情況，并統(tǒng)計病斑的大小。發(fā)現ERF基因沉默后，在侵染24h和36h時，與對照(pTRV2)相比，病斑面積比值分別是1.952和1.332; WRKY1基因沉默后，病斑面積比值分別是1.556和1.080。本氏煙對煙草疫霉的感病性增強，說明轉錄因子ERF和WRKY1可能參與了本氏煙疫霉抗性過程。
　　ERF和WRKY1調控已知的誘導型啟動子GmaPPO12的活性:實驗室前期研究證明，GmaPPO12基因啟動子在疫霉誘導早

6、期能夠快速驅動報告基因的上調表達，是疫霉誘導型啟動子，并證明它與植物的疫霉抗性相關。為了研究ERF和WRKY1轉錄因子是否參與調控與已知的疫霉誘導型啟動子的活性，我們將該啟動子與GUS報告基因融合，利用VIGS技術和煙草瞬時表達體系(Transient expression assays inNicotiana benthamiana)，檢測轉錄因子沉默后，誘導性啟動子驅動報告基因的GUS蛋白酶活、化學組織GUS染色以及GUS基因轉錄水

7、平的表達量，來探究轉錄因子ERF和WRKY1是否參與調控疫霉誘導型啟動子GmaPPO12的活性。結果表明，在本氏煙中沉默ERF和WRKY1基因，疫霉誘導型啟動子GmaPPO12驅動GUS基因的活性降低，說明轉錄因子ERF和WRKY1分別參與了疫霉誘導型啟動子GmaPPO12的誘導表達。
　　通過上述的研究，我們在本氏煙中篩選到與植物抗病性相關的轉錄因子ERF和WRKY1基因。并明確其參與調控已知的疫霉誘導型啟動子GmaPPO12的