大豆ACC合酶的活性與純化研究.pdf

1、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶(ACC合酶)是高等植物內(nèi)源激素乙烯合成路徑的限速酶，其傳統(tǒng)的活性檢測(cè)方法是氣相色譜法，主要是通過(guò)氣相色譜檢測(cè)最終產(chǎn)物乙烯的量來(lái)對(duì)ACC合酶活性進(jìn)行間接推算。這在內(nèi)源乙烯釋放量少，ACC合酶含量低的干果類(lèi)植物，如大豆等材料中的研究受到一定程度的限制。本文以植物內(nèi)源激素乙烯生成路徑為依據(jù)，提出并建立以高效液相色譜為主體的ACC合酶活性檢測(cè)體系，利用電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)，對(duì)體系的可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。

2、 在對(duì)大豆黃化幼苗下胚軸部分的ACC合酶提取過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)主要活力集中在40﹪-60﹪的硫酸銨飽和沉淀中。反應(yīng)溫度30℃，pH值8.0時(shí)，酶活力較高，且S-腺苷蛋氨酸(SAM)自身分解微弱，適合于高效液相色譜(HPLC)酶活體系分析，而對(duì)材料進(jìn)行傷害處理會(huì)顯著提高酶的比活力。本研究采用陰離子交換層析和凝膠層析對(duì)粗酶進(jìn)行了純化，結(jié)果表明陰離子交換層析上樣緩沖液pH值為7.0時(shí)可去除粗酶中大量雜蛋白而不影響目的蛋白；凝膠層析可進(jìn)一步去

3、除小分子雜蛋白。ACC合酶不穩(wěn)定，3天即喪失提取當(dāng)日活力的90﹪。在反應(yīng)溫度為30℃，pH值為8.0的條件下，傷害處理的大豆黃化幼苗下胚軸部分提取的ACC合酶對(duì)底物SAM催化反應(yīng)的米氏方程為：y=972.47x+2.19×106，米氏常數(shù)Km為443.3μmol·L-1。應(yīng)用該檢測(cè)體系，對(duì)八種不同品系大豆的種子活力指標(biāo)與ACC合酶活性水平的關(guān)系進(jìn)行了初步的探索。結(jié)果顯示，不同大豆品種間的種子活力與ACC合酶的比活力呈顯著正相關(guān)，這表明內(nèi)