有機(jī)磷農(nóng)藥降解質(zhì)粒在土壤中的轉(zhuǎn)化規(guī)律研究.pdf

1、土壤是地球上最大的生物多樣性寶庫(kù)，土壤微生物間的基因交流是提高生物適應(yīng)環(huán)境和生存能力的重要途徑，也是形成土壤生物群落多樣性的遺傳信息基礎(chǔ)。隨著遺傳工程微生物向土壤環(huán)境中的釋放呈日益增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這些微生物及其攜帶的用以提高農(nóng)作物產(chǎn)量或修復(fù)治理污染的遺傳基因在環(huán)境中的安全及歸宿引起了科學(xué)工作者及公眾的廣泛關(guān)注。本文以革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）、革蘭氏陰性細(xì)菌惡臭假單胞菌（Pseudomonas putid

2、a）及多種典型土壤礦物為材料，綜合應(yīng)用等溫吸附與解吸、等溫滴定量熱和衰減全反射紅外光譜技術(shù)，測(cè)定了DNA與細(xì)胞-礦物復(fù)合物作用過(guò)程吸附量、親和力、熱力學(xué)參數(shù)及基團(tuán)變化，以揭示其與土壤組分的相互作用機(jī)制。并以有機(jī)磷農(nóng)藥降解質(zhì)粒為對(duì)象，結(jié)合熒光定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)等方法，研究了游離態(tài)及固定態(tài)胞外DNA在環(huán)境中的存留時(shí)間，及向土著微生物進(jìn)行水平轉(zhuǎn)移的可能性。獲得如下主要結(jié)果:
　　(1)揭示了DNA在土壤細(xì)菌-礦物復(fù)合物上的吸附行為及

3、作用機(jī)制。選取鮭魚(yú)精DNA、兩種常見(jiàn)的土壤細(xì)菌（枯草芽孢桿菌和惡臭假單胞菌），以及三種典型土壤礦物（高嶺石、蒙脫石和針鐵礦）為實(shí)驗(yàn)材料。表明所有細(xì)菌-礦物復(fù)合物對(duì)DNA的吸附可用Langmuir方程擬合。DNA在枯草芽孢桿菌-礦物復(fù)合物上的吸附量相比其在兩種單一組分上的等比例吸附值之和有所提高，表明細(xì)菌與礦物的吸附能增加該體系對(duì)DNA的吸附量。DNA與枯草芽孢桿菌-礦物復(fù)合物結(jié)合時(shí)的焓變主要來(lái)自細(xì)菌與DNA分子，其主要作用力為范德華力及

4、氫鍵。DNA與惡臭假單胞菌-礦物復(fù)合物相互作用的情況則受到礦物類(lèi)型的影響，其與惡臭假單胞菌-高嶺石復(fù)合物進(jìn)行吸附時(shí)主要作用力為范德華力及氫鍵;而與惡臭假單胞菌-蒙脫石/-針鐵礦的作用力則應(yīng)歸結(jié)于脫水作用及水分子重排引起的熵增。
　　(2)成功構(gòu)建攜帶雙重標(biāo)記的有機(jī)磷農(nóng)藥降解質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)游離及固定態(tài)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率受質(zhì)粒類(lèi)型、礦物種類(lèi)及宿主類(lèi)別等多因素影響。以有機(jī)磷高效降解質(zhì)粒pB17、廣宿主載體pBHR1及抗重金屬細(xì)菌惡臭假單胞菌X4

5、的小質(zhì)粒為材料，對(duì)其進(jìn)行增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因egfp及卡那霉素抗性基因kmr雙重標(biāo)記，得到重組質(zhì)粒pRB17、pXr及pBr。并對(duì)三種游離態(tài)質(zhì)粒及與蒙脫石、高嶺石、針鐵礦吸附后的固定態(tài)質(zhì)粒進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室水平的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，以廣宿主載體為基礎(chǔ)所構(gòu)建的降解質(zhì)粒具有向更多種類(lèi)細(xì)菌轉(zhuǎn)移的能力。游離態(tài)的DNA較固定態(tài)DNA有更高的降解速率。DNA與礦物吸附后進(jìn)行轉(zhuǎn)化，所獲得轉(zhuǎn)化子的數(shù)量有不同程度的降低。游離態(tài)pBr轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α其轉(zhuǎn)化

6、效率可達(dá)2.98×105個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，而與蒙脫石、高嶺石及針鐵礦吸附后，轉(zhuǎn)化效率分別下降了2～4個(gè)數(shù)量級(jí)。類(lèi)似的結(jié)果也出現(xiàn)在pXr轉(zhuǎn)化DH5α的過(guò)程中，與三種礦物結(jié)合后的轉(zhuǎn)化效率下降了1～3個(gè)數(shù)量級(jí)。表明與DNA親和力強(qiáng)的礦物降低DNA轉(zhuǎn)化效率的作用更明顯。
　　(3)闡明了游離及固定態(tài)質(zhì)粒在土壤環(huán)境中的穩(wěn)定性特征及生物可利用性。結(jié)果表明DNA在進(jìn)入土壤的最初階段降解迅速，3～7天后降解曲線(xiàn)逐漸平緩。游離態(tài)DNA較固定態(tài)D

7、NA在土壤中的降解速度更快，經(jīng)DNA回收轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，其轉(zhuǎn)化效率的下降也更為顯著。DNA被不同類(lèi)型礦物吸附后其降解效率也存在差異。與高嶺石和針鐵礦相比，吸附于蒙脫石表面的DNA分子降解速率更慢，在第3天時(shí)殘留量仍保持在50％以上，而且第15天仍能成功轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。表明蒙脫石對(duì)DNA具有更好的保護(hù)作用，使其能免受核酸酶的降解，具有更長(zhǎng)時(shí)間的生物可利用活性。
　　(4)比較了多種檢測(cè)環(huán)境中小概率水平基因轉(zhuǎn)移事件的實(shí)驗(yàn)手段，提出抗

8、生素富集聯(lián)用流式細(xì)胞分選術(shù)能有效分離土壤中的罕見(jiàn)目標(biāo)細(xì)胞。證實(shí)了胞外DNA具有向土著微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)移的能力。選擇游離態(tài)及蒙脫石固定態(tài)質(zhì)粒pBr及pXr作為土壤轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)DNA供體，武漢市兩處地點(diǎn)的棕紅壤作為受體細(xì)菌來(lái)源，土樣樣品設(shè)置堆肥或有機(jī)磷農(nóng)藥處理組。利用熒光顯微鏡、標(biāo)記基因PCR擴(kuò)增及流式細(xì)胞術(shù)直接對(duì)土壤中的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)限均低于2×10-6，未能檢測(cè)到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的存在。通過(guò)抗生素富集及流式細(xì)胞多輪分選技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行篩選可有效將