骨形態(tài)發(fā)生蛋白4促進Tbx18+心外膜祖細胞向起搏細胞分化及其機制研究.pdf

1、竇房結是位于上腔靜脈與右心耳交界處天然起搏點。隨著人口老齡化加劇，SAN病變所致的心源性暈厥和猝死發(fā)病率逐年增加。闡明胚胎心臟發(fā)育過程中調(diào)控SAN起搏細胞的分化發(fā)育網(wǎng)絡及各胚胎發(fā)育因子在其中所扮演的角色對構建適應生理需要的生物起搏具有重大意義。心外膜祖細胞具有向成纖維細胞、血管平滑肌細胞、竇房結起搏細胞等心系細胞分化的潛能性，大部分心外膜祖細胞表達Tbx18轉錄因子。Tbx18缺失導致竇房結頭部結構嚴重缺失。因此，Tbx18+心外膜祖細

2、胞可能是構建生物起搏器最值得研究的種子細胞之一。在胚鼠成纖維細胞向心肌細胞轉化的直接基因重組探索實驗中，增加骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）因子可將有規(guī)律自發(fā)起搏功能的心肌轉化率提高近150倍。因此，明確BMP4對Tbx18+心外膜祖細胞向起搏細胞分化的作用及其作用機制具有重要價值。本研究通過構建Tbx18-Cre/Rosa26REYFP體外譜系示蹤模型，探索BMP4對Tbx18+心外膜祖細胞向起搏細胞分化的作用及調(diào)控機制。
　　第一

3、部分、Tbx18-Cre和YFP轉基因小鼠的繁殖與鑒定
　　目的：分別繁殖、鑒定出攜帶Tbx18-Cre轉基因雌性小鼠和條件性Cre報告雄性小鼠Rosa26REYFP并將兩種轉基因小鼠用于交配建立基于雙雜合小鼠的譜系示蹤模型，為下一步示蹤胚胎心臟Tbx18+細胞的分化命運提供實驗基礎。
　　方法：將Tbx18-Cre和Rosa26REYFP轉基因雄鼠分別與育齡期C57BL/6雌鼠進行交配、繁殖，應用“一管酒精基因組抽提法”提

4、取基因組，PCR鑒定子代基因型。
　　結果：成功篩選、鑒定攜帶Tbx18-Cre轉基因雌性小鼠和條件性Cre報告雄性小鼠Rosa26REYFP。
　　結論：建立了簡捷、高效率的大樣本基因組篩選技術平臺，成功繁殖Tbx18-Cre轉基因雌性小鼠和Rosa26REYFP雄性小鼠，為后續(xù)實驗提供了實驗動物。
　　第二部分、建立Tbx18+心外膜祖細胞譜系示蹤模型
　　目的：培養(yǎng)出純度高、生長狀態(tài)良好的E11.5天心外膜

5、祖細胞，建立Tbx18+心外膜祖細胞譜系示蹤模型。
　　方法：通過Tbx18-Cre雌鼠和Rosa26REYFP雄鼠交配，取E11.5天胚胎心臟進行貼片培養(yǎng)，胎鼠組織用于PCR鑒定基因型，心臟外層細胞爬出后顯微鏡下篩選Tbx18+心外膜祖細胞。
　　結果：熒光篩選法可簡便、有效篩選出Tbx18+示蹤心外膜祖細胞。超過95%的E11.5天胚胎心外膜祖細胞是Tbx18陽性細胞。
　　結論：通過Tbx18-Cre/Rosa2

6、6REYFP雙轉基因雜合小鼠模型，建立Tbx18+心外膜祖細胞譜系示蹤模型，可示蹤Tbx18+心外膜祖細胞的分化命運。
　　第三部分、BMP4促進Tbx18+心外膜祖細胞分化為起搏細胞
　　目的：探索BMP4是否調(diào)控Tbx18+EPCs向起搏細胞分化。
　　方法：實驗分為BMP4組、BMP4+LDN193189組、空白對照組、LDN193189組進行干預，通過免疫熒光和熒光定量PCR法分別檢測起搏細胞標志物HCN4的表

7、達。
　　結果：BMP4干預促進Tbx18+心外膜祖細胞HCN4表達上調(diào)，隨干預時間延長，HCN4表達增多。
　　結論：BMP4促進Tbx18+心外膜祖細胞分化為起搏細胞。
　　第四部分、BMP4調(diào)控Tbx18+心外膜祖細胞向起搏細胞定向分化的機制研究
　　目的：探索BMP4促進Tbx18+心外膜祖細胞向起搏細胞分化的調(diào)控網(wǎng)絡。
　　方法：實驗分為BMP4組、BMP4+LDN193189組、空白對照組、LD

8、N193189組進行干預，熒光定量PCR法檢測BMP4、SHOX2、Tbx3、GATA4、Nkx2.5基因轉錄水平，篩選出BMP4的作用靶點，行免疫熒光檢測蛋白表達水平。進一步通過RNAi技術抑制BMP4下游靶點，分為BMP4組,BMP4+GATA4-RNAi組，空白對照組，陰性對照組，GATA4-RNAi組，檢測GATA4、BMP4、HCN4、Nkx2.5，明確上下游關系。
　　結果：熒光定量PCR顯示，BMP4上調(diào)GATA4m

9、RNA表達、下調(diào)Nkx2.5mRNA表達，對SHOX2、Tbx3、BMP4表達無影響。免疫熒光檢測提示BMP4上調(diào)GATA4表達、下調(diào)Nkx2.5mRNA表達，對細胞內(nèi)BMP4表達無影響。熒光定量PCR和免疫熒光觀察到，RNAi有效下調(diào)GATA4的表達，GATA4-RNAi干預使HCN4下調(diào)、Nkx2.5上調(diào)，細胞內(nèi)BMP4表達無改變。
　　結論：BMP4通過上調(diào)GATA4促進Tbx18+EPCs向起搏細胞分化，同時發(fā)現(xiàn)Nkx2.