大環(huán)內酯類抗生素的酶活性抑制效應及構效關系研究.pdf

1、我國現已成為抗生素生產與消費的第一大國，也是濫用抗生素最嚴重國家之一，大部分抗生素不能完全被機體吸收，有高達85％以上抗生素以原形或代謝物形式由病人和畜禽排泄物排入環(huán)境，由此帶來的環(huán)境健康風險問題逐漸引起關注。
　　為了對大環(huán)內酯類抗生素的環(huán)境行為進行系統(tǒng)分析，本文實地調查了畜禽養(yǎng)殖中抗生素使用情況，在此基礎上選取了11種典型大環(huán)內酯抗生素，通過實驗室系統(tǒng)的測試工作，實施了大環(huán)內酯類抗生素對酶的活性抑制實驗，運用專業(yè)化學辦公軟件構

2、建了大環(huán)內酯抗生素的結構簡圖并對其結構參數進行了計算，借助統(tǒng)計分析手段，探究大環(huán)內酯類抗生素的結構與性質之間的定量關系。為進一步研究大環(huán)內酯抗生素在環(huán)境中的遷移轉化規(guī)律，本文最后建立了高效液相色譜法檢測大環(huán)內酯類抗生素的方法體系。主要研究結果簡述如下:
　　1.通過對安徽省宣城市某鄉(xiāng)鎮(zhèn)大型養(yǎng)殖公司及多家私人養(yǎng)殖戶進行走訪調查，發(fā)現畜禽養(yǎng)殖中抗生素的使用上存在不少問題，主要有以下六個方面:(1)盲目、隨意用藥問題突出;(2)過量、長

3、期使用抗生素情況普遍;(3)禁用抗生素的使用時有發(fā)生;(4)人藥獸用現象依然存在;(5)藥物配伍不當現象明顯;(6)不按規(guī)定休藥期用藥。
　　2.根據大環(huán)內酯類抗生素抑菌作用機制，通過分析大環(huán)內酯類抗生素對酶活性抑制作用研究現狀，以大環(huán)內酯抗生素對酶活性的抑制效應為突破口，選取乙酰膽堿酯酶和谷氨酰轉肽酶作為靶標酶，通過測試大環(huán)內酯脅迫下乙酰膽堿酯酶（促進神經傳導）和谷氨酰轉肽酶（促進轉肽作用）的抑制效應，結合大環(huán)內酯分子結構特征，

4、揭示大環(huán)內酯類抗生素對酶抑制機理。
　　(1)在實驗過程中采用的有機溶劑會對酶產生一定的影響，為選取適宜的有機溶劑，減少對實驗結果的影響，根據文獻分析，在酶活性抑制前期實驗中，選取了甲醇、乙醇、異丙醇、冰醋酸、丙酮、乙腈、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯和氯仿10種有機溶劑，測定了其對酶活性的影響。10種有機溶劑對兩種酶的抑制能力順序基本一致，但又存在差別，本文分別選取乙醇和乙腈作為對乙酰膽堿酯酶和谷氨酰轉肽酶抑制作用實驗

5、用有機溶劑。
　　(2)本文測試了11種典型大環(huán)內酯類抗生素對乙酰膽堿酯酶和谷氨酰轉肽酶的系列抑制程度，并用直線內插法計算了相應的半數抑制濃度IC50(50％ InhibitoryConcentration)，結果表明在較低濃度下，大環(huán)內酯類抗生素對兩種酶的抑制作用較弱，其中對乙酰膽堿酯酶抑制能力排序為:制霉素＜羅紅霉素＜麥迪霉素＜吉他霉素＜乙酰螺旋霉素＜阿奇霉素＜紅霉素＜泰樂菌素＜阿維菌素＜克拉霉素＜兩性霉素B，其中兩性霉素B的

6、抑制強度是制霉素的455倍;對谷氨酰轉肽酶抑制能力排序為:乙酰螺旋霉素＜麥迪霉素＜吉他霉素＜制霉素＜紅霉素＜克拉霉素＜羅紅霉素＜泰樂菌素＜阿奇霉素＜阿維菌素＜兩性霉素B，其中兩性霉素B的抑酶強度是乙酰螺旋霉素的950倍，接近3個數量級。對兩種酶抑制作用最強的均為兩性霉素B，根據其分子結構簡圖可以看出兩性霉素B分子中含羥基數量最多，易通過氫鍵與酶結合，從而影響并改變酶分子構象，減少酶分子與底物結合或者降低其結合穩(wěn)定性，致使酶催化活性減弱。

7、
　　3.為進一步揭示有機溶劑與大環(huán)內酯抗生素對酶活性抑制的機理，建立了有機溶劑和大環(huán)內酯類抗生素對兩種酶活性抑制的QSAR（QuantitiativeStructure-Property/Activity Relationships）模型。以有機溶劑和大環(huán)內酯類抗生素對酶的抑制率為因變量，以分子結構參數為自變量，運用統(tǒng)計軟件SPSS，通過多元線性逐步回歸方法建立QSAR模型，根據模型穩(wěn)健性檢驗并結合引入參數分析解釋有機溶劑和大環(huán)

8、內酯類抗生素對酶抑制作用機理。
　　(1)有機溶劑對乙酰膽堿酯酶的抑制作用QSAR模型:有機溶劑對酶的抑制率IR（Inhibition Ratio）=-193.939+147.660*(AAC)+112.824*(SEige), n=10, R=0.960, R2=0.921, F=41.055,Sig=0.000, P=0.4。
　　方程中參數AAC和SEige均為二維拓撲指數描述符，AAC表征原子組成平均信息指數，SEi

9、ge表征電負性特征值總數，兩種描述符的引入說明有機溶劑原子間的組合方式決定整個有機溶劑分子的電負性，并且隨著兩種描述符數值的增加，有機溶劑對酶的抑制率增強，因此有機溶劑對乙酰膽堿酯酶活性抑制作用取決于有機溶劑的原子組成和分子電負性。
　　(2)大環(huán)內酯對乙酰膽堿酯酶的抑制作用QSAR模型:IC50=9354.291-1216.501*(GGI3)-93.782*(RDF105e), n=11, R=0.934, R2=0.872,

10、F=31.054, Sig=0.000, P=0.2。
　　GGI3表征拓撲電荷指數，為二維空間結構Galvez拓撲指數描述符。RDF105e表征原子電負性加權的徑向分布函數，為三維空間結構的RDF描述符，兩種描述符的引用說明大環(huán)內酯類抗生素對乙酰膽堿酯酶的抑制作用主要取決于其分子結構特定方向上的電負性，并隨電負性的提高，抑制率增強。
　　(3)有機溶劑對谷氨酰轉肽酶的抑制作用QSAR模型:IR=68.985-176.102

11、*(E3u), n=10, R=0.920, R2=0.846, F=29.058, Sig=0.000149。
　　E3u參數為WHIM指數，表征未加權第三主軸Z軸方向上的指向性指數，說明有機溶劑對谷氨酰轉肽酶抑制效應主要受其特定方向上的原子連接性影響。
　　(4)大環(huán)內酯類抗生素對谷氨酰轉肽酶抑制作用QSAR模型:IC50=41337.302-8477.261*(GGI3)+415.436(RDF060p), n=11,

12、 R=0.897, R2=0.805,F=16.531, Sig=0.00, P=0.000。
　　模型中GGI3為拓撲電荷指數，表征二維空間結構Galvez拓撲指數描述符。RDF060p表征原子極化率加權的徑向分布函數，為三維空間結構的RDF描述符，兩種描述符的引用說明大環(huán)內酯類抗生素對谷氨酰轉肽酶的抑制作用主要取決于其分子結構特定方向上的極化率。
　　有機溶劑與大環(huán)內酯類抗生素對兩種酶的抑制作用基本是一致的，主要取決于特

13、定方向上的電負性與極化率，但由于兩種酶的分子空間排列不同，導致有機溶劑對乙酰膽堿酯酶的抑制程度相比谷氨酰轉肽酶增加;大環(huán)內酯分子進攻酶分子的點位不同，進攻乙酰膽堿酯酶點位編號105，進攻谷氨酰轉肽酶點位編號060。
　　4.為幫助課題組進一步系統(tǒng)分析大環(huán)內酯類抗生素的遷移轉化規(guī)律，根據實驗室現有條件建立了大環(huán)內酯類抗生素的檢測方法。本研究中阿奇霉素的色譜保留時間為2.067min，紅霉素為2.305min，克拉霉素2.158min