Surfactin高產(chǎn)菌的高通量誘變篩選、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化及提取.pdf

1、surfactin是一種由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的生物表面活性劑之一。它是由7個(gè)氨基酸和一個(gè)長(zhǎng)脂肪酸鏈組成（C13-C15）。在環(huán)境治理以及醫(yī)療方面有著巨大的利用價(jià)值。然而surfactin生產(chǎn)的高成本和低產(chǎn)率限制了其商業(yè)應(yīng)用的范圍。本研究主要構(gòu)建了 surfactin高產(chǎn)菌株的常壓室溫等離子體技術(shù)（atmospheric pressure and room temperature plasma, ARTP）誘變及高通量篩選模式，在5L發(fā)酵罐

2、水平對(duì)surfactin的發(fā)酵方式進(jìn)行了研究并優(yōu)化，并通過(guò)制備液相獲得了surfactin純品。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴采用ARTP對(duì)原始菌株Bacillus subilis E7進(jìn)行快速誘變。以培養(yǎng)9 h左右的菌種為誘變初始條件，最佳誘變處理時(shí)間為220 s，根據(jù)菌株形態(tài)差異對(duì)誘變所得菌株進(jìn)行表觀初篩，以表觀初篩為基礎(chǔ)，進(jìn)一步結(jié)合經(jīng)典血平板法通過(guò)對(duì)菌株在血平板上溶血圈大小快速篩選出產(chǎn)surfactin菌株。⑵采用24孔深孔板

3、代替普通三角瓶對(duì)誘變菌株進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以提高篩選通量。借助酶標(biāo)儀對(duì)surfactin與CPC-BTB（氯化十六烷基吡啶-溴百里酚藍(lán)）試劑反應(yīng)后的顏色變化進(jìn)行檢測(cè)，可快速篩選出surfactin高產(chǎn)突變株。孔板復(fù)篩所得到的菌株使用三角瓶發(fā)酵驗(yàn)證，高效液相（high performance liquid chromatography, HPLC）檢測(cè)結(jié)果證明突變株Bacillus subtilis SF90-5 surfactin產(chǎn)量由0.

4、12 g/L提升至0.8 g/L，產(chǎn)量增加了7倍。ARTP快速誘變，表觀初篩，溶血圈初篩，孔板復(fù)篩，多功能酶標(biāo)儀快速檢測(cè)，搖瓶驗(yàn)證，HPLC檢測(cè)相結(jié)合的方法提高了篩選通量，加快了篩選進(jìn)程，成功構(gòu)建出 surfactin高產(chǎn)菌株的高通量誘變篩選體系。⑶使用不同方式進(jìn)行surfactin的5 L罐水平發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)果表明直接排泡發(fā)酵液損失嚴(yán)重，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率低，surfactin產(chǎn)率較低；添加豆油做消泡劑后無(wú)法抑制泡沫產(chǎn)生且對(duì)后期提取工作造成

5、困難。最終確定以泡沫收集回流的方式進(jìn)行surfactin的5 L罐水平發(fā)酵，并在該模式基礎(chǔ)上增加消泡塔，進(jìn)一步加強(qiáng)了回流的有效性。通氣及攪拌轉(zhuǎn)速的組合實(shí)驗(yàn)表明，二者過(guò)高會(huì)導(dǎo)致劇烈的起泡現(xiàn)象，過(guò)低無(wú)法保證菌體正常生長(zhǎng)代謝所需溶氧，均不利于surfactin的發(fā)酵生產(chǎn)。經(jīng)對(duì)比后在通氣1 vvm，攪拌轉(zhuǎn)速300 rpm條件下獲得surfactin最高產(chǎn)量，為2.392g/L。⑷發(fā)酵液上清酸沉處理后使用大孔樹(shù)脂吸附并洗脫，得到脂肽類(lèi)生物表面活性