N-乙酰神經氨酸特異性生物傳感器的構建及生產菌株優(yōu)化.pdf

1、N-乙酰神經氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)及其衍生物參與許多生理和病理過程，在食品、藥品和保健品行業(yè)都有極大的應用潛力。傳統(tǒng)的天然產物提取法過程繁瑣、效率低下，難以滿足市場需求?，F(xiàn)階段，酶法合成和全細胞生物催化是生產NeuAc的主要途徑。但這兩種方法都需要添加丙酮酸和GlcNAc作為前體物，價格比較昂貴。
　　利用葡萄糖或其它廉價碳源直接發(fā)酵生產NeuAc十分具有吸引力，因為該過程可以一步合成N

2、euAc而不需要添加任何直接前體物。前期實驗中，在大腸桿菌中構建了一條葡萄糖起始的NeuAc合成途徑(DN5/pNnsGM)。菌株發(fā)酵時中間產物GlcNAc大量積累，ManNAc和丙酮酸也有一定量積累。通過在發(fā)酵過程中外源添加丙酮酸，NeuAc產量提高了104.6％，這說明相對于ManNAc來說，丙酮酸是不足的。于是本論文在一株實驗室已有的丙酮酸高產菌株中表達了NeuAc合成途徑，但未能實現(xiàn)NeuAc積累;本論文嘗試在DN5中過表達gl

3、k增加丙酮酸供給，結果影響不大。
　　接下來，本論文以大腸桿菌K1來源的NeuAc合酶neuB替換掉pNnsGM中的nanA，希望通過最后一步反應的單向性增加產物合成。DN5/pB發(fā)酵積累1.75g/L NeuAc，較DN5/pNnsGM提高了1.55倍，中間產物GlcNAc和ManNAc濃度提高了一倍多，而丙酮酸的濃度降低。為降低乙酸積累，本論文在DN5基礎上敲除了磷酸乙酰轉移酶基因pta得到DN6菌株，發(fā)酵DN6/pB時，乙酸

4、積累由4.62g/L減少到1.55g/L。
　　為提高細胞內PEP的水平，本論文在DN6基礎上敲除了葡萄糖專一性的磷酸轉移酶系統(tǒng)中膜整合蛋白ⅡCBGlc編碼基因(ptsG)構建了DN7菌株以阻斷PTS系統(tǒng)，減少PEP消耗。DN7/pB發(fā)酵48h積累1.48g/L NeuAc，較DN5/pB緩慢;中間產物ManNAc濃度稍高(2.63vs.1.17g/L)，沒有檢測到丙酮酸。
　　隨后本論文敲除了編碼PEP羧化酶的ppc基因，

5、得到重組菌株DN8。DN8/pB發(fā)酵70h積累2.0g/L NeuAc，葡萄糖消耗速率僅為0.26g/L/h，生物量積累明顯受到影響。這可能是因為ppc編碼的PEP羧化酶是大腸桿菌C4回補途徑的重要一環(huán)，它不可逆地催化PEP與二氧化碳反應生成草酰乙酸，回補TCA循環(huán)。因此該基因的缺失一定程度上影響了菌體生理，使得糖耗減慢。
　　本論文在1L罐上對DN8/pB進行了發(fā)酵優(yōu)化，最終在37℃、高溶氧條件下(4vvm)，發(fā)酵52h積累Ne

6、uAc4.15g/L。但在5L罐發(fā)酵時菌株生長很差、產量很低，說明發(fā)酵條件需要進一步優(yōu)化。
　　微生物利用簡單底物生產小分子化合物的能力是十分驚人的，但是由于生理代謝的復雜性，理性改造常常收效甚微。從這個意義上，隨機突變加高通量篩選策略有其獨特優(yōu)勢。但是，突變體的表征卻成為新的限制性因素，因為合成的大多數小分子不會賦予生產菌株易于篩選的表型。生物傳感器的應用在很大程度上解決了這一問題。它們能夠感應胞內代謝物的濃度變化，并通過報告基

7、因以熒光、酶活或者偶聯(lián)細胞生長的方式起到高通量篩選的作用，對微生物代謝途徑改造和菌株進化研究意義重大。2013年，Cho等人利用SELEX方法篩選到了NeuAc特異性的RNA適配子，為NeuAc生物傳感器的開發(fā)奠定了基礎。
　　通過將該適配體酶與組成型強啟動子PJ23106、緩沖序列、報告基因相連，本論文構建了NeuAc特異性的RNA傳感器。當胞內NeuAc結合在RNA適配子之后引起整個開關的構象變化，導致錘頭型核酶發(fā)生自剪切，產

8、生一個缺口，暴露出新的5’羥基并在大腸桿菌內源RNase J1核酸酶的作用下，由5’→3’方向對mRNA進行剪切，從而降低下游報告基因的豐度。
　　以sfgfp為報告基因時，12mM的外源NeuAc造成高達11.8倍的熒光抑制，證明外源添加NeuAc的量可以與報告基因gfp的表達偶聯(lián)。之后本論文用tetA代替gfp建立了基于Ni2+的高通量篩選系統(tǒng)。TetA編碼一個四環(huán)素/H+轉運蛋白并且可以用作雙向篩選標記。TetA的表達賦予細

9、胞四環(huán)素抗性，同時使細胞對毒性金屬離子如NiCl2更敏感。細胞內NeuAc濃度的增加將激活適配體酶的自剪切進而降低TetA的表達，減少Ni2+的泵入，因此具有更高胞內NeuAc濃度的細胞在NiCl2條件下更具有生長優(yōu)勢。
　　為了使培養(yǎng)基的干擾最小化，本論文采用了成分較為簡單的M9B基本培養(yǎng)基。在預實驗中，本論文確定了該培養(yǎng)基中Ni2+的最佳篩選濃度為50μM，在該濃度下，TetA過表達造成的生長抑制最明顯。在0-86.4±5.1

10、mg/g cdw胞內NeuAc范圍內，50μM Ni2+條件下，細菌生長與胞內NeuAc濃度成正比。本論文還發(fā)現(xiàn)，構建的NeuAc傳感器在乳酸菌中同樣有活性，在0-25.6mM外源NeuAc范圍內，傳感器工作良好，這也說明在不同的物種間核酶的工作機制十分相似，暗示基于RNA的傳感器可能具有更好的種間適應性。
　　隨后本論文進行了模擬篩選以驗證篩選系統(tǒng)的可用性。本論文構建了NeuAc高產菌株DN5/pB與原始菌株DN5/pNnsGM

11、(1∶100)混合的模型文庫。在篩選壓力下，僅通過一輪篩選，DN5/pB富集超過16倍，證明了該系統(tǒng)可以用于菌株進化。本論文嘗試在質粒pB的基礎上通過優(yōu)化NeuAc合成途徑中四個基因的表達來提高NeuAc生產。本論文設計了兩種RBS文庫，分別包含497，664和65，536種突變體，經過初步表征，來自文庫一的菌株積累NeuAc能力更強，所以在接下來的實驗中采用了文庫一。
　　將文庫在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞達到指數后期時，將培養(yǎng)物

12、按1％轉接到新鮮的篩選培養(yǎng)基中。在三次連續(xù)傳代（稱為一個富集循環(huán)）后，提取質粒并重新轉化新鮮親本菌株以防止細胞產生對鎳離子的適應性突變。通過3輪篩選進化，富集到3個高產質粒p1e、p2、p3e，富集率超過40％。富集質粒中，neuB、slr1975、GNA1三個基因的表達強度較pB高（除了p2e-GNA1），但glmS強度較低。其中產量最高的DN5/p2e較原始菌株NeuAc產量提高了34％，達到2.12g/L。在此基礎上本論文對Neu

13、Ac合酶NeuB進行了隨機突變，經過4輪篩選進化，富集了B1、B3兩個突變體，富集率分別為56.5％和45％。DN5/pB1產量為2.24g/L，DN5/pB3產量為2.61g/L（相比DN5/p2e提高了23％）。本論文將NeuB突變體進行了蛋白表達純化并對其酶活進行了測定，B3較野生型提高了27％，B1較野生型提高了9.4％。
　　為探究單個氨基酸突變及組合的氨基酸突變對酶活及NeuAc生產的影響，本論文構建了C1，C2和C3

14、突變體。但遺憾的是，未能進一步提高NeuAc產量。為衡量DN5/pB3生產NeuAc的能力，本論文采用無機鹽培養(yǎng)基進行了雙階段發(fā)酵。在該策略中，要求產物生產與細胞生長不存在偶聯(lián)。第一階段是生物量積累階段，第二階段是將積累的細胞重懸到適當的緩沖液中進行產物生產。經44h發(fā)酵，菌株積累8.31g/L NeuAc。副產物方面，丙酮酸和GlcNAc積累量較多，其余如ManNAc、甲酸、乙酸、乙醇較少。通過對發(fā)酵初始生物量的優(yōu)化，NeuAc產量進

15、一步提高到12.52g/L。
　　本論文采用不可逆的NeuAc合酶進行葡萄糖起始的NeuAc發(fā)酵生產，并對宿主菌進行了相應的積累PEP的改造，一定程度上提高了NeuAc的產量和產率。通過偶聯(lián)細胞生長的NeuAc高產菌株高通量篩選系統(tǒng)的建立，本論文利用隨機突變對NeuAc生產途徑進行了表達強度優(yōu)化并對關鍵酶NeuAc合酶進行了突變篩選，進一步提高了菌株的生產能力。該篩選系統(tǒng)還可以應用于NeuAc途徑其它酶的篩選，同時也為其它RNA傳