海棲熱袍菌中嗜熱酶基因的克隆及發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、二十一世紀，開發(fā)和利用海洋生物資源已成為全球關注點之一，對極端海洋環(huán)境微生物的研究也上了一個新層次。因此對極端酶的研究也廣泛引起了海內外專家的興趣，尤其嗜熱酶已經在許多領域有了較好的應用。海棲熱袍菌（Thermotoga maritime）是一種來源于深?；鹕降臉O端嗜熱菌，生長環(huán)境特殊難以大規(guī)模的發(fā)酵培養(yǎng)，其酶資源用于工業(yè)化生產十分困難。使用基因工程手段對極端環(huán)境微生物的酶基因加以克隆并進行高效表達，是目前利用極端環(huán)境微生物酶資源的主要

2、方法。
　　本課題主要研究了海棲熱袍菌表達的內切-1,4-β-葡聚糖酶(TM1525)、阿拉伯內切-1，4-β-半乳聚糖酶(TM1201)、磷酸戊糖變位酶(TM1067)三種嗜熱酶。采用基因克隆技術構建表達嗜熱酶的基因工程菌，通過層析柱處理加以純化成功表達的外源蛋白酶，已有文獻報道嗜熱磷酸戊糖變位酶（PPM）的主要酶活性質，因此本文應用響應面法對工程菌發(fā)酵產PPM的條件進行優(yōu)化。本文的主要研究內容及結果如下：
　　1.以海棲

3、熱袍菌（Thermotoga maritima）基因組為模板，根據(jù)內切-1,4-β-葡聚糖酶、阿拉伯內切-1，4-β-半乳聚糖酶、磷酸戊糖變位酶三種嗜熱酶基因序列設計引物，質粒pET-32a(+)為表達載體，E.coli BL21(DE3)為表達菌株，成功構建表達海棲熱袍菌嗜熱酶的三種工程菌。
　　2.研究三種工程菌的生長曲線，以IPTG為誘導劑進行誘導表達，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白免疫印跡等方法進行檢測，結果顯示內切-1,4

4、-β-葡聚糖酶、阿拉伯內切-1，4-β-半乳聚糖酶未在工程菌中成功表達，磷酸戊糖變位酶成功表達。
　　3.運用生物信息學軟件，對成功表達的目的蛋白酶理化性質進行分析；采用Ni-NTA樹脂層析柱對目的蛋白進行純化，結果顯示可以得到電泳純的磷酸戊糖變位酶。
　　4.通過Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗和Box-Behnken試驗設計構建回歸方程對磷酸戊糖變位酶發(fā)酵條件進行優(yōu)化。結果顯示，最佳發(fā)酵條件為誘導種齡OD