血漿載脂蛋白apoai的分離純化

1、血漿載脂蛋白血漿載脂蛋白AIAI（ApoAIApoAI）的分離純化）的分離純化[目的與要求目的與要求]掌握并提高生化實驗基本原理及技術；了解生物大分子分離方案的設計及路徑；培養(yǎng)生物化學領域的科研設計的能力。[原理原理]生物大分子主要是指蛋白質、酶、多糖和核酸。迄今已知的生物大分子的分離純化方法很多，主要利用它們之間特異性的差異，如分子量大小、分子形狀、酸堿性、溶解度、極性、電荷和對其它分子的親和力等建立起來的。其主要原理基本可歸納為兩個

2、方面，一是利用混合物中幾個組分分配系數的差異，把它們分配到兩相或多相中，如鹽析、鹽溶、有機溶劑沉淀、共沉淀、層析和結晶等；二是將混合物置于單一的物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于不同區(qū)域而達到分離的目的，如電泳、超速離心、超濾等。目前純化蛋白質的3種關鍵方法是電泳、超速離心和層析。由于生物大分子不能加熱熔化、汽化，所能分配的物相只限于固相和液相、并在這兩相之間交替進行分離純化。因此，可將生物大分子制備方法按分子大小和形狀、帶電性質

3、、溶解度、酸堿性、對其它分子的親和力等主要因素分類（見下表）。性質具體方法分子大小和形狀溶解度電荷差異生物功能專一性差速離心、超濾、分子篩、透析鹽析、有機溶劑沉淀、等電點沉淀等電泳、等電聚焦、離子交換層析、吸附層析親和層析、疏水層析、共價層析在實際工作中，往往綜合使用上述幾種方法才能制備出一種純化的生物大分子。分離純化生物大分子總希望純度好、產率高，但實際上，兩者不能兼得。因此考慮分離純化條件和方法時，不得不在兩者間作適當的選擇。一般，

4、科研上更多考慮純度，工業(yè)生產上更多選擇產率。在進行實踐前，應進行充分的調查研究，查閱有關文獻資料，對自己欲分離純化的物質的物理、化學及生物學性質先有一定的了解，然后進行實驗工作。對于一個未知的生物大分子試樣進行創(chuàng)造性的分離純化時，首先要確定研究的主要目的。如分離純化肽類物質或酶類等，可參考已有的肽類或酶類物質分離純化方法進行反復的摸索比較，找到一些工作規(guī)律，逐步達到預期的結果。在分離純化工作中，另一重要工作是建立相應的分析鑒定方法及生物

5、活性測定方法，即對目的活性物質跟蹤分析，以便正確指導分離純化工作一步步順利深入進行，若要提純一生物大分子達到一定純度，一般要經過多種方法、步驟和不斷變化操作條件才能達到目的，因此，整個實驗過程中，各種方法的優(yōu)劣，選擇條件其效果的好壞，均需通過分析鑒定和生物活性測定來判斷。生物大分子一般需經過下列步驟（或其中幾個步驟）才能分離純化達到所需的要求。一、前處理一、前處理包括生物材料的選擇及處理、細胞破碎、細胞器分離及目的物提取。選材主要根據實

6、驗目的而定，從工業(yè)生產角度選材，注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、成本低的動植物組織或微生物材料原料?？蒲薪嵌冗x材，則只需符合實驗預定目標的要求即可。材料選定后，必須盡可能保持新鮮，盡快加工處理。如不立即進行實驗或加工，則應冷凍保存。若材料是提取液、體液（如血）、代謝排出液（如尿）、細胞外某些多肽激素、蛋白質、酶等則不需破碎細胞。若為細胞內生物活性物質則需細胞破碎，如科研上材料處理量少，則可用勻漿器或超聲波處理法破碎；若處

7、理材料量較大，則可用高速組織搗碎機。操下較穩(wěn)定，所以盡可能采用堿性條件。四、結晶四、結晶結晶是蛋白質分離的最后步驟。蛋白質和酶的結晶影響因素和條件如下：1.純度蛋白質純度愈高，就愈容易結晶。大多數生物大分子第一次得到結晶后，仍可以進行多次重結晶，每次重結晶純度均有一定提高，直至恒定為止。2.濃度溶液愈濃，就愈容易結晶，若在過飽和的溶液中結晶，雜質含量多，且晶形也不好，故樣品濃縮至一定濃度或所得沉淀溶解至合適濃度后，緩慢地加入鹽溶液或有機

8、溶劑至呈現微弱渾濁或略處于過飽和狀態(tài)，然后放置在一定溫度下，待其靜止地、慢慢地析出結晶，此時才酌情補充加入少量的鹽或有機溶劑使其結晶完全。如加入的鹽或溶劑過多，沉淀出來的不是晶體，可逐滴加入蒸餾水或對水透析，促使沉淀轉化為結晶。3.pH值結晶的溶液pH值一般選擇在被結晶的蛋白質或酶的等電點處，可有利于晶體的析出。4溫度低溫條件下，蛋白質和酶不僅溶解度低，而且不易變性失活。因此有利于這些物質結晶。溫度可在410℃范圍內選擇。5晶種蛋白質和

9、酶不易結晶，如胰島素往往加入少量胰島素晶體可導致大量結晶的形成，有時用璃棒輕輕刮擦容器壁也可以達到此目的。五、干燥和樣品保存五、干燥和樣品保存生物大分子的制備得到所需的產品后，為了防止變質、保持生物活性、易于保存和運輸，常常要干燥處理，最常用的方法是真空干燥和冷凍干燥，某些無活性核酸、微生物酶制劑和酪蛋白等工業(yè)產品則較多地應用噴霧干燥、氣流干燥等直接干燥法。保存方法與生物大分子穩(wěn)定性及保持生物活性的關系很大，生物大分子的保存可分為干粉和

10、液態(tài)兩種。但不論是干粉或液態(tài)都應避免長期暴露于空氣中防止微生物的污染。溫度對生物大分子的穩(wěn)定性和生物活性影響很大，故一般生物大分子物質都在低溫(04℃)保存，保存時間也不宜過長，否則，會招致樣品的變質或失活。干粉保存的制品一般比較穩(wěn)定，如制品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數個月甚至數年沒有顯著變化。儲藏方法也很簡單，只將干燥后的樣品置于干燥器內(內裝有干燥劑)密封，在04℃冰箱中保存即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸

11、水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶，每次用時，只取出一小瓶。液態(tài)保存對保持生物大分子活性是不利的，故只在一些特殊情況下采用，并需要嚴格的防腐保護措施，保存時間也不宜過長，常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質和酶常用的穩(wěn)定劑有硫酸銨、蔗糖、甘油等，某些金屬離子如鈣、鎂、鋅等對某些酶也有一定的保護作用。在生物大分子分離提純的過程中，經常需要測定某一大分子的含量和某一大分子的提純程度(即跟蹤分析)。這些分析工作還包括鑒定最后制品的純度。

12、生物大分子含量的測定是一項復雜而重要的工作，除采用通用方法外，還常用特異的方法，無法逐一介紹，這里僅作一般性方法介紹。測定多糖總量常用的方法有：菲林試劑法、蒽酮法、旋光法等。測定蛋白質和酶總量常用的方法有：凱氏定氮法、雙縮脲、Folin酚試劑法、Bied染色測定法、紫外吸收法等。測定蛋白質混合物中某一特定蛋白質的含量通常要用具有高度特異性的生物學方法。具有酶或激素性質的蛋白質可以利用它們的酶活性或激素活性來測定含量；利用抗體抗原反應，也