醫(yī)藥衛(wèi)生分子流行病學概述及我國分子流行病

1、分子流行病學概述及我國分子流行病學研究現(xiàn)狀,提綱：一、分子流行病概述 (一)定義 (二)分子流行病學研究內容和范圍 (三)分子流行病學常用的主要研究方法二、我國分子流行病學研究現(xiàn)狀 (一)病原體分型和檢測研究 (二)人群中疾病流行規(guī)律、傳播機理研究 (三)在慢性病研究中的應用 (四)在遣傳性疾病研究中的應用

2、 (五)在疾病防治方面的應用三、存在問題和前景 (一)存在問題 (二)前景,流行病學是研究人群中疾病和健康的分布，探索影響分布的因素，并在此基礎上制定預防策略的措施的一門學科。一直以來，流行病學在疾病的預防和治療，疾病危險因素的研究和控制方面都起著十分重要的作用。近二三十年來，生物學技術尤其是分子生物學技術取得了突破性進展，并逐漸滲透到各個醫(yī)學領域。分子生物學的理論和技術不斷應用于傳統(tǒng)的流行病

3、學，并在此基礎上形成了一門新的分支學科——分子流行病學。,一、分子流行病學概述,（一）定義 分子流行病學是應用先進的實驗技術測量生物學標志，結合流行病學現(xiàn)場研究方法，從分子水平闡明疾病的病因及其相關的致病過程，并提出與評價相應防治措施的科學。這一定義包含了幾個要點：（1）分子流行病學是流行病學的一個分支，是傳統(tǒng)流行病學與新興的生物學技術，特別是分子生物學技術之間的一門邊緣學科、交叉學科；（2）分子流行病學的主要研究對象是各種生物

4、學標志；（3）與傳統(tǒng)流行病學不同，分子流行病學還研究暴露因子引起疾病的相關過程，以測定各種易感性標志，并提出針對性預防措施，尤其是阻斷暴露因子進入體內后致病進程的初級預防措施。,,圖1 傳統(tǒng)流行病學與分子流行病學的關系（Schulte，1993）,表1 傳統(tǒng)和分子流行病學的比較 傳統(tǒng)流行病學 分子流行病學推動力 公共衛(wèi)生

5、 現(xiàn)代科學研究水平 人群 個體/器官組織/細胞/分子研究樣式 人口統(tǒng)計學/社會科學 臨床/實驗認識論策略 自上而下 自下而上預測水平 人群 個體,,,,綜合上

6、述國內外學者的分子流行病學研究實踐及其對分子流行病學的理解，提出如下定義：分子流行病學是應用先進的實驗技術測量生物學標志，結合流行病學現(xiàn)場研究方法，從分子水平闡明疾病的病因及其相關的致病過程，并提出與評價相應防制措施的科學。,1．疾病病因的探討 疾病的發(fā)生，大多是環(huán)境因素與遺傳因素同時起作用。只是有些疾病以環(huán)境因素為主，有些則正好相反。遺傳因素起重要作用的疾病往往與基因有關，這不言而喻；而很多與環(huán)境因素有關的疾病，

7、也常常需從基因方面去研究，因為環(huán)境因素可以通過宿主的基因突變或異常表達引起疾病。因此，分子流行病學研究在這方面起著非常重要的作用。,（二）分子流行病學研究內容和范圍,意大利學者Dragani在1996年名古屋會議上報告，以前一般認為肺癌的家庭聚集性很少見，故基因因素的作用很小。但他從小鼠模型發(fā)現(xiàn)染色體上存在易感或抑制肺癌的基因位點。此后作者在人群中選擇病理確診的肺腺癌125例作為病例組，另在健康供血員人群中隨機選擇179名作普通人群對照

8、檢測顯示，在KRAS2基因第2外顯子下游有個基因位點與拮抗肺癌產生并延長肺癌患者的生存期有關。,表2 肺腺癌病人和普通人群對照中KRAS2 Rsal等位基因的基因型頻率,,基因型a,普通人群,肺腺癌,觀察數(shù),期望數(shù)b,,,A1/A1A1/A2A2/A2,966815,8959 4,81.557.812.7,,計,179,152,152,,注：a：等位基因A1為無酶切位點；A2為有酶切位點； b：按

9、普通人群的頻率推算所得； c：卡方檢驗Ρ=0.025。,2．危險因子致病機制的研究 分子流行病學不僅研究環(huán)境與宿主體內的致病因子，而且著重研究這些致病的危險因素，特別是化學物質與生物活性物質從暴露開始至疾病發(fā)生全過程的各個環(huán)節(jié)。,癌癥發(fā)病的分子流行病學研究是個典型的例子。20多年來，對與癌相關的各種生物學標志，致癌物的種種生物效應標志，如DNA加成物（adduct）等等進行了十分廣泛的研究，有關報道

10、相當豐富，積累了很多資料，提出了一些很有意義的假設。目前認為，致癌化學因子進入體內，最終引起臨床癌癥過程的基本框架大致如下。致癌作用是多階段的，正常細胞轉變?yōu)榘┘毎?jīng)歷了致癌作用累積而又連續(xù)的幾個階段：啟動（initiation）、促進（promotion），轉化（conversion）和發(fā)展（progression）。在啟動階段，機體暴露于環(huán)境致癌化學物質，致癌物進入體內需經(jīng)代謝活化（metabolic activation），變成反

11、應性親電物質（reactive electrophilic form），再與DNA反應形成DNA加成物。在致癌物進入體內后，這種反應通常僅需幾小時就可完成。當DNA復制時，這種對DNA的化學損傷可引起基因的變化，這些基因的變化如果逃避了DNA修復作用，就會被固定下來。某些基因損傷可造成癌基因的活化或抑癌基因的失活，從而使正常細胞變成啟動細胞。這個過程往往僅需幾天時間。但促進過程卻是人類致癌過程中最長的階段，啟動細胞呈克隆樣擴展需10年甚

12、至更長。促進階段的細胞還需經(jīng)過進一步的基因改變，并獲得侵襲性與轉移的惡性表型，才能進入轉化與發(fā)展階段，而這后2個階段大概需1~2年的時間。,,圖2 分子流行病學和癌的發(fā)展過程及其三級預防策略,3．疾病易感性的測定 個體對疾病都存在一定的感受性，稱之為易感性。以往一般認為，只有傳染病才有確定的易感性，可以用測定機體內是否存在某種特異性保護（中和）抗體的方法了解其對某種傳染病是否具有易感性或免疫力。然而，近來分子生物

13、學與免疫學研究發(fā)現(xiàn)，機體對很多疾病也同樣存在著易感性，且往往與個體的某些基因型別或序列或其表達產物有關，如果與遺傳有聯(lián)系，往往稱之為遺傳易感性（尤其慢性病）。同時還發(fā)現(xiàn)很多傳染性疾病的易感性，除了與能刺激機體產生特異性抗體的致病微生物有關外，也和機體的某些基因類型有聯(lián)系，因為后者決定了機體對致病微生物的免疫反應的方式與強度。,對于常見的慢性疾病的遺傳易感性的分析，可以應用同時檢測特異基因標志的病例對照研究進行。例如，如果某個特異性的等位

14、基因在某病病人中明顯高于對照，這就提示該等位基因的存在可能使機體對某病具有一定的易感性。目前，與遺傳易感性相關研究較多的一個基因區(qū)域是人類第6號染色體短臂上的人類白細胞抗原（HLA），其原因可能有二，首先HLA基因區(qū)有高度的多態(tài)性，其次為HLA的功能是介導對特異性抗原的免疫反應。Erlich的研究發(fā)現(xiàn)，HLAⅡ類單倍體（DRB1﹡1501-DQ B1﹡0602）的比例在受到人乳頭瘤狀病毒（HPV）16型感染的宮頸癌與重度異常增生的病人中

15、明顯升高。,4．流行規(guī)律的研究 這方面研究最多的是傳染病。在傳播范圍的確定，傳播途徑的判斷與傳染源的追索方面，分子流行病學可以發(fā)揮無與倫比的作用。因為以往常常是根據(jù)宏觀流行病學調查分析，再輔以病原體分離與血清學分型來分析流行規(guī)律。然而近年的很多分子流行病學的研究表明，上述的方法有時不夠精確。例如，盡管傳染源與接觸者之間的病原體的血清學型別一致，但如果基因型不一致，就不能確切判定兩者的傳播關系。,（1）傳播范圍的確定

16、 按照傳染病流行病學基本理論，在一次爆發(fā)或流行中，其受染范圍的確定應根據(jù)如下原則：在爆發(fā)或流行期間，有共同或有效暴露史，經(jīng)過一個平均潛伏期發(fā)病或出現(xiàn)急性感染的生物學標志可判定為受染者，然后總計受染人員，結合這些人員活動的區(qū)域，以確定受染或流行涉及范圍?？墒?，過去測定的生物學標志主要是屬于血清學、免疫學、微生物學范圍，缺乏基因型標志，因而可能出現(xiàn)錯誤的判斷。分子流行病學研究縮小了常規(guī)流行病學調查所推測受染范圍，從基因水平上證實爆發(fā)的受染

17、人數(shù)與傳染來源。,（2）傳播途徑的判定 以往，傳染病流行中傳播途徑或傳播媒介的調查通常使用排除法，同時盡可能在媒介物中分離到引起流行的病原體或檢測到病原學標志。近來分子流行病學研究引入一些新的技術，如分子進化診斷（molecular evolutionary diagnosis）。例如，不少分析性流行病學研究與血清流行病學研究均認為丙肝病毒（HCV）可經(jīng)性傳播途徑感染配偶。然而，出人意料的是，在1993年東京國際病毒性肝炎會議有2篇報

18、道，用分子進化法進行的研究提出了相反的意見。如Ohno篩檢50對至少有一方抗-HCV陽性的夫婦，發(fā)現(xiàn)僅4對夫婦雙方抗-HCV均陽性。用PCR擴增、測序分型，結果其中2對配偶男女之間的HCV RNA彼此的基因型別不同，由此可排除性傳播所至；另2對夫婦之間型別相同，用分子進化診斷判定男女病毒株的分株時間（divergence time），發(fā)現(xiàn)第1對配偶的分株時間發(fā)生在45~52年前，而結婚卻才32年；第2對配偶分株時間已有30~34年，結婚

19、時間則在25年前?；谶@些研究結果，作者認為HCV經(jīng)性傳播的可能性很小。,（3）傳染源的追索 判定傳染來源或兩人之間的傳播關系應符合如下4條原則：①A（傳染源）與B（受染者）的接觸是有效接觸（暴露）；②接觸發(fā)生在A的傳染期內；③B的發(fā)病時間是在暴露后該病最短與最長潛伏期之間；④A與B受染致病的血清學型別一致。如今看來，第④條應該用基因型別來代替，而基因序列的測定與型別差異的鑒定雖然比較復雜與精細，但可靠得多。,美國1990~1991年

20、報道佛羅里達一個口腔診所有1名患有艾滋病的牙醫(yī)，被他看過病的患者中有7名后來感染了HIV，然而經(jīng)過分子流行病學研究發(fā)現(xiàn)，其中5名患者的HIV與牙醫(yī)的HIV有共同的氨基酸特異模式（signature pattern），而且序列的差異率<5.0%，為同一病毒株；而另2名患者的HIV則與牙醫(yī)的不同。因此，通過序列分析，從分子水平確定了前5名病人的HIV感染是由牙醫(yī)引起，而后2名病人的傳染來源則不是牙醫(yī)。,5．防制措施的研究

21、 （1）傳染病預防 因為在傳染病流行的研究中應用了分子生物學等現(xiàn)代技術，對傳播與流行范圍的確定，傳播途徑、傳播媒介與因子以及傳染來源的推斷更為精確，所以提出的控制措施更有針對性，更有成效。 傳染病預防中最可靠的手段是疫苗接種。已有很多傳染病由于實施了安全、有效、廣泛的免疫接種，發(fā)病率已大幅度地下降。 但少數(shù)疫苗由于某些原因可以使極個別疫苗接種者發(fā)生被免疫的疾病。過去，僅能根據(jù)接種史與分

22、離病原體作血清學或生化反應來進行判斷，但可靠性不強。而現(xiàn)在用分子生物學技術作基因序列分析可以確實地判定是否為疫苗株引起的發(fā)病。,（2）非傳染病的預防 由于分子流行病學不僅研究疾病的危險因素，而且研究其引起疾病整個過程中的所有環(huán)節(jié)，也即研究這些致病因子的致病機制，因此，這就為疾病的三級預防特別是第I、II級預防采取針對性措施奠定了科學的基礎。在這個意義上也可以說，分子流行病學的建立，為疾病的三級預防開辟了十分廣闊的前景。

23、 圖-2以癌癥為例，描繪了應用分子流行病學方法研究致癌因子導致正常細胞基因改變===選擇性克隆擴增====基因改變====細胞異質化====臨床癌癥過程的主要階段，以及針對這些改變所能采取的不同階段的具體預防與干預措施：防止暴露、預防最終致癌因子的形成、阻斷其與宿主基因間的相互作用、抑制癌前起始或啟動細胞的產生、抑制選擇性克隆的擴散、早期診斷、手術與放射治療、化學治療；預防復發(fā)與繼發(fā)腫瘤。,,圖2 分子流行病學和癌的發(fā)展過程及

24、其三級預防策略,分子流行病學在某種意義上講，是一種流行病學宏觀與實驗室微觀結合的方法學，需要現(xiàn)場流行病學調查研究與實驗室先進的檢測技術相結合。因此，分子流行病學的研究方法大致可以分為二大類：實驗室技術與流行病學現(xiàn)場研究方法。,（三）分子流行病學常用的主要研究方法,1．實驗技術 （1）基因序列分析 通過需測定的基因（靶基因）序列提取，克隆入測序載體或用PCR直接電泳測序。這是測定基因核酸序列及其類型、突變部位與方式的最可靠的

25、方法，在傳染病與非傳染病分子流行病學研究中都十分常用。但技術操作比較復雜，分析也需細致并具備一定經(jīng)驗，在國內，目前還只在一些大學、研究所、大醫(yī)院等開展，表3常用檢測基因變異方法。,表3 基因變異的檢測和篩查方法比較,注：+ —可用，—不宜用；A—完全確定；B—不完全確定；C—不能確定。,（2）分子進化分析（molecular evolutionary analysis） 用核酸序列測定技術結合計算機分析，確定流行中感染的病原株之間的

26、親緣關系和序列突變時其時間，以研究傳播關系和病原體的進化。所以目前主要用于傳染病的研究。 （3）單鏈構象多態(tài)性（single-strand conformation polymorphism，SSCP）分析 其簡要操作步驟與原理為：將被檢的靶基因PCR擴增后變性為單鏈核酸，然后進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，觀察區(qū)帶的遷移率。由于遷移率與核酸的構象密切相關，甚至1個堿基的突變都可以改變構象，產生電泳遷移率的差異。因此，藉此可

27、以檢出基因的突變，而不需要測序。SSCP簡便，價格便宜，已被很多學者應用傳染病與非傳染病的研究。國內也有些單位在使用，然而由于影響因素多，需要操作技術熟練，重復性差，尚未被普遍使用。另外，SSCP不能判斷DNA變異的確切部位與方式，如要作深入研究，還需進行序列測定。,（4）基因芯片技術（DNA chip） 基因芯片是指固定有許多有序列的寡核甘酸探針的載體，通過雜交檢測，對各種基因進行分析。由于它所具有的高通量性、快速、敏感、便宜等優(yōu)點

28、，在多個領域起到越來越重要的作用?；蛐酒驹硎峭ㄟ^原位雜交方法，用已知的DNA序列檢測未知序列。目前主要用于DNA突變分析，基因譜差異分析，基因診斷分析和大規(guī)模基因類型分析。其研制技術主要包括以下幾大步驟：寡核苷酸探針合成、固定、雜交和檢測。,2．現(xiàn)場分子流行病學研究方法 傳統(tǒng)的現(xiàn)場流行病學研究方法，即描述性研究，分析性研究與干預性研究均可應用于分子流行病學。也可以說，在傳統(tǒng)的流行病學研究中，結合檢測一些生物學標

29、志，以從分子水平更深層次揭示病因聯(lián)系或致病因子的致病機制。目前較常用有2種。,（1）巢式（套式、嵌入式）病例對照研究（nested case control study） 運作開始是按隊列研究的方式進行：選擇一隊列，收集基線資料，采集所需研究的生物學標志的組織或體液標本儲存?zhèn)溆?，然后隨訪到出現(xiàn)能滿足病例對照研究樣本量的病例數(shù)為止。把這些病例作為病例組，按配比條件，從同一隊列中選擇1或數(shù)個非病例作對照，抽出病例與對照的基線資料并檢測收集

30、的標本，資料按配比病例對照研究處理，其他的非病例及其資料，標本均可不用。由于此種研究是按隊列研究設計進行，資料收集和生物標本采集均在發(fā)病前，觀察的又是生物學標志，故因果關系清楚，資料可靠，論證強度高；而標本檢測與資料處理又按病例對照研究方法，故省錢省時省力，可以說兼有隊列研究與病例對照研究兩者之優(yōu)點。,（2）病例-病例研究（case-case study） 在病例對照研究的病例組中，臨床類型可以不同，如腦卒中有出血型、缺血型，冠心病有

31、心梗型、無心梗型；某些生物學標志往往也是不均一的，即部分病例有某種生物學標志，而其余的則沒有。那么就可把不同的臨床類型或具有標志的這些病例與無標志的病例，按病例對照研究的方式處理資料，以探討不同臨床類型的危險因素的差異或者這個生物學標志與該疾病的其他危險因素之間的關系和相互作用。這就能比普通病例對照研究提供更多的信息與線索。在病例對照研究的基礎上再作如此處理，可達到事半功倍之效?；蛘呤褂脝渭儾±?病例研究可免除選擇對照，特別是免除從無病

32、對照中采取生物標本的麻煩與困難。如食管癌的病例對照研究中發(fā)現(xiàn)，130例食管癌患者中，用免疫組化檢測到p53基因表達異常的有68例，按病例-病例研究處理，無論是單因素或Logistic回歸分析，均顯示吸煙、食管癌家庭史與p53基因表達異常有關，OR值分別為2.3~3.2和2.8~3.8；吸煙還有劑量效應，表明吸煙與食管癌家族史很可能是食管癌p53基因異常表達的危險因素。,二、我國分子流行病學研究現(xiàn)狀,國內自1985年始，將分子生物學技術和

33、方法：DNA雜交、基因酶切圖譜分析、序列分析（DNA、AAA）和PCR等技術應用于流行病學中疾病診斷以及追蹤傳染源的調查研究。使疾病早期快速、可靠的基因診斷提供了手段，而且使基因分離、克隆表達與序列分析等技術更加簡便、高效。另一方面由于流行病學研究的深入，一些傳統(tǒng)的表型（Phenotype）檢測方法。如染色、形態(tài)、培養(yǎng)特征、生化反應、血清學試驗等已不能完全滿足疾病的病因與傳播途徑精確判別的需要，也不能完全適應一些非傳染性疾病病因及制病制

34、理的探討。因此，在短短的十幾年中，國內分子流行病學經(jīng)歷了由產生到起步發(fā)展的過程，并取得重大發(fā)展。,（一）病原體分型和檢測研究 分子流行病學研究最早開始用于傳染病的病原體基因分型，并調查病原體的分布規(guī)律。在傳染流行中，對病原體進行準確的分型，對疾病的防治十分重要。由于病原體表型特征的不穩(wěn)定性和易變性，以表型特征研究的分型方法，如血清學、生化學等，就存在缺陷。而基因型是遺傳特征，相當穩(wěn)定可靠，可以作為病原體鑒定和診斷的重要依據(jù)。細菌的產毒

35、、耐藥特性都與細菌質粒有關，徐兆煒等（1986年）對在同一地區(qū)分離的134株痢疾桿菌進行質粒圖譜分析，發(fā)現(xiàn)雖然部分菌株耐藥譜不同，但仍可呈現(xiàn)為相同的質粒圖譜，這對鑒定菌株，追蹤耐藥菌株來源極有幫助。rRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA的DNA序列，屬保守基因序列。徐文斌等（1996年）對不同地區(qū)、不同時間分離到的119株傷寒沙門氏菌進行rRNA(RTs)的基因多態(tài)性分析，119株細菌可分為38個RTs，其中RT9和RT11是造成我國傷

36、寒流行的主要RTs。對于病毒的分型，可以采取先進行病毒的細胞培養(yǎng)，病毒增殖到一定程度后，提取病毒DNA，再進行限制性內切圖譜分析。,PCR技術的出現(xiàn)，使對病原體分析過程更加簡化、快捷。首先設計引物，PCR擴增病原體DNA中一段保守的基因片段，然后進行酶切分析。例如，蘇虹等（1997年）利用逆轉錄-多聚酶鏈反應（RT-PCR）和限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）分析安徽HCV基因型的分布，結果表明，安徽HCV感染以II型為主，其中北部地區(qū)I

37、II型感染多于南部，而II型北部少于南部。對病原體的基因型、多態(tài)性、變異型可以應用單鏈構象多態(tài)性（SSCP）、脈沖場電泳（PFGE）以及序列分析等多種方法進行分析。,基因的多態(tài)性也表現(xiàn)為酶分子的多態(tài)性，對酶分子的多態(tài)性的研究，也可了解不同病原體間遺傳關系、分類分型。段廣才等（1996年）應用多位點酶電泳法（MEE）對471株霍亂弧菌進行分類，結果證實古典型和埃爾托型流行株遺傳關系緊密；非流行株相互間流行關系較遠。O139群與O1群流行株

38、有相同的霍亂毒素（CT）片段，應按流行株對待。 對病原體的檢測，以往多使用病原體培養(yǎng)、生化分析、血清學和免疫學檢測等，上述方法都存在各種缺陷，如檢測時間長、靈敏度、特異度不高等。利用放射性同位素標記探針檢測病原體，是一種靈敏、特異的檢測方法。除用同位素標記探針外，更多的使用非同位素如地高辛、生物素等標記探針，增加了安全性。核酸分子雜交方法檢測病原體，在流行病學研究中應用日益增多。王云飛等（1994年）對不同基

39、因型人乳頭瘤病毒（HPV）在宮頸癌、尖銳濕疣等中起不同作用進行了研究，證明HPV 11/6型引起性傳播的尖銳濕疣；而HPV16/18型則與宮頸癌關系密切，HPV52/58型與宮頸關系還有待證實。,PCR不僅可以用基因分型、克隆和序列分析，還可用于檢測病原體。郭恒彬等（2002年）以構建的Rt外膜主要蛋白56kDa型特異抗原（tsa56kDa）基因編碼區(qū)的群、型特異引物，采用1步法PCR分別對Gilliam，Karp，Kato，Kawas

40、aki和Kuroki 5株標準株Rt，江蘇地區(qū)5份Rt陽性標本，斑點熱和莫氏立次體以及5份正常輸血員全血標本進行檢測和分型。研究結果證明所構建的Rt群、型引物具有Rt的特異性，型特異引物在Rt的型與型之間無交叉擴增。因此，該研究對恙蟲病的診斷、流行病學調查以及Rt的型別鑒定具有實用價值。 2003年全國SARS爆發(fā)流行，用分子流行病研究其病尤為必要。如SARS在廣東流行可分三個階段：早期由病人分離到的SARS病

41、毒與果子貍分到的SARS病毒只差27個堿基對，因此懷疑SARS是一種動物來源的病；中期SARS病毒分子結構穩(wěn)定，病毒傳播力強，超級傳播事件發(fā)生多；后期SARS病毒堿基短缺可達幾百個，病毒的傳播力大大減少。,2004年4月蘇北某鎮(zhèn)在學齡兒童中爆發(fā)一種病。疾癥狀以發(fā)熱，上感和扁桃體腫大為主。病人雖發(fā)熱39℃，但還能騎自行車外出，無肺部征象。到6月份，全鎮(zhèn)共發(fā)生783例。少數(shù)病例培養(yǎng)出鏈球菌，用各種抗菌素后未能控制。5月11日全鎮(zhèn)停課，但病例

42、未能減少，6月1日重新上課。6月4日藥費了20萬元，用阿奇霉素口服預防。隨著病情漸緩，疾病有向周邊擴散趨勢。針對這一原因不明疾病，我們首先對20例病人進行了細胞培養(yǎng)，20例中14例有細胞病變（70%），經(jīng)診斷是一種腺病毒感染（其中半數(shù)以上熒光抗體和PCR陽性）。再進行序列測定證明為腺病毒3型的一次流行。,（二）人群中疾病流行規(guī)律、傳播機制研究 目前疾病在人群中流行的現(xiàn)象比以往更加復雜，已由三環(huán)節(jié)二因素向三要素，甚至四要素發(fā)展。病因已由

43、單病因、單效應，向多病因、單效應，甚至多病因、多效應發(fā)展。傳播機制也由水平傳播、垂直傳播（母嬰傳播）到混合傳播。疾病侵入人體途徑亦日益復雜。疾病中隱性病例與顯性病例的比例不斷上升，非典型和隱性感染者越來越多。傳染病的潛伏期和非傳染病的潛隱期也越來越長了，而發(fā)病的頻率則越來越低。因此，使用傳統(tǒng)的檢測方法，調查傳染源、傳播途徑，確定疾病流行規(guī)律，就往往存在一定的困難。,解決上述困難的主要途徑之一是發(fā)展分子流行病學。使檢測手段更加先進、敏感度

44、和特異度更高。HBV的垂直傳播一直是人們關注的問題，既往的有關研究，都缺乏直接的證據(jù)，證明垂直傳播的存在。唐時幸等（1991年）使用核酸分子雜交法，從胎兒胎盤組織中檢測到HBV DNA，說明HBV可通過胎盤屏障感染胎兒，而且調查還發(fā)現(xiàn)，母親HBV DNA陽性，胎兒宮內感染的機會大大增加。HBV可以通過母親傳染給胎兒，還可能由父親傳染給后代。王培林等（1998年）對乙型肝炎患者家系進行分子流行病學調查，比較男性患者病前所生子女HBV DN

45、A U5樣序列片段檢出率及HBsAg、HBeAg和抗-HBc陽性率，都顯著低于男性患者病后所生子女，提示HBV可能通過HBV DNA整合的精子，使后代感染HBV。,分析病原體，分離鑒定其亞型，對于追蹤傳染源和傳播途徑，采取相應的預防措施，有重要意義。2003年陰寧等對中國經(jīng)血傳播人群中艾滋病病毒-1與丙型肝炎病毒亞型分布研究中，以聚合酶鏈反應（PCR）技術擴增HIV-1 gag的p17區(qū)和env的C2V3區(qū)，HCV5ˊNCR區(qū)和E1/E

46、2區(qū)，并對擴增產物進行測序。采用ClustalW軟件對所得序列進行基因樹分析。結果共檢測了239例HIV-1感染者，其中HCV陽性率為56.9%（136/239）。在136例HIV-1/HCV混合感染者中，93.6%是通過靜脈吸毒（IVDU）和不潔獻血途徑而感染的。其中HCV基因型為1b、3a、3b和4型。而不潔（輸）獻血人群的HIV-1主要為B型，其HCV基因型以1b和2a為主。,（三）在慢性病研究中的應用 隨著生活水平的提高，以及

47、疫苗的廣泛使用，傳染病的發(fā)病率和死亡率逐漸降低，而心血管病、腫瘤等慢性疾病的發(fā)病率和死亡率在不斷上升，成為威脅人類健康的主要疾病。因此，對慢性病的病因研究有重要意義。,1腫瘤 （1）癌變是一個復雜的多階段過程 癌變過程的復雜性和對致癌因素反應的個體間差異，是腫瘤分子流行病學的兩條基本原理，兩者的相互作用構成了癌變的復雜多階段過程。 癌變的復雜性體現(xiàn)在它是一個多因素、多基

48、因和多途徑的過程，癌變過程的中心生物學事件是癌基因的活化和抑癌基因的失活，引起這些改變的除DNA序列變化外，目前認為表遺傳學改變（epigenetic，指僅影響基因的活性，而不改變基因的結構，如DNA甲基化程度等，產生可遺傳的表型的改變）也起重要的作用。以往認為，癌變按啟動、促進和演進的三個階段的發(fā)生模式，從目前大腸癌等完成的研究結果看來，這個模式有些簡單化，實際上癌相關基因的改變發(fā)生在癌變的每一階段，它促進了具有生存優(yōu)勢克隆的選擇性擴

49、增和細胞惡性程度的提高。在不同類型的癌，甚至同一種癌的獨立起源癌灶間，所發(fā)生遺傳學改變的關鍵基因種類、數(shù)目和順序都可能是不同的。這些提示，可能存在多種基因功能異常的途徑導致腫瘤的形成。,（2）生物標記 分子流行病學應用經(jīng)驗證與人癌變過程相關，存在于細胞、組織和體液中的生物標記（biomarker），鑒定癌的危險因素，評價個體腫瘤易感性，從暴露人群篩選高危個體和亞群，檢出臨床前早期生物學反應和形態(tài)學改變，為早期的預防和干預提供

50、了機會。因此生物標記的研究在分子流行病學研究中起著重要的作用。生物標記通常分為三類：①暴露生物標記：包括內部劑量如體液中致癌物或其代謝產物的濃度，以及效應劑量如DNA加合物；②效應生物標記：包括早期生物學改變如染色體畸變、微核和基因突變等，以及與癌變相關的形態(tài)結構和功能的變化等；③易感性生物標記：包括癌相關基因的多態(tài)性等。目前研究較深入的三個代表標記均與遺傳學相關。,①DNA加合物 致癌劑殘基與DNA共價結合形成的加合物，提供了特殊致

51、癌劑暴露和原始DNA損傷的證據(jù)，并反映了外源性致癌劑暴露、吸收、代謝和DNA修復等相關易感性因素互相作用后的綜合效應，其中PAH-DNA和AFB1-DNA加合物被成功地用來證明PAH和AFB1分別為肺癌和肝癌的重要危險因素或病因之一。 ②突變譜 突變譜是指經(jīng)誘變劑作用后，基因內突變體的分布情況，主要是由突變熱點所決定。p53抑癌基因在細胞的正常功能調控和癌變過程中起重要作用，是研究突變譜的理想候選基因,大量研究表明: p

52、53基因內的錯義突變是非隨機分布，在不同類型的人類癌癥中發(fā)現(xiàn)了突變熱點。熱點的產生是由于特定密碼子對特殊致癌因子的易誘變性，或是某種突變細胞的選擇生長優(yōu)勢和克隆擴增的結果。若一種致癌因子誘發(fā)的腫瘤總產生同樣的突變譜，則支持該因子起病因作用。致癌因子暴露與癌癥間的分子聯(lián)系最好的例證是肝癌、皮膚癌和肺癌的p53基因的突變譜（表4）。另一方面，內源性機制產生的突變譜則不同于因暴露誘發(fā)的突變譜，例如，在大腸癌發(fā)現(xiàn)2/3以上的突變是C/T堿基轉換

53、。,表4 致癌因素暴露、p53基因突變和癌,,暴露,癌的類型,P53突變,食物中的AFB1U．V．煙草煙霧,肝細胞肝癌皮膚鱗癌和基底細胞癌肺癌,G-T或G-C顛換，特別是密碼子249在二聚體位置的C-T轉換G-T顛換，特別是密碼子157、248、273,,,③ 遺傳多態(tài)性 遺傳多態(tài)性或變體是指在一個群體中，特定位點上經(jīng)常同時出現(xiàn)兩個或兩個以上的等位基因，其中最低的等位基因頻率遠超過基因突變頻率。遺傳多態(tài)性的分子基礎是DN

54、A序列的變異性，其中約90%為單核苷酸多態(tài)性（SNP）。積累的大量研究資料表明，代謝酶、DNA修復蛋白和受體等的基因的多態(tài)性，決定了腫瘤等疾病的易感性、藥物的反應性和疾病臨床表現(xiàn)在不同人群和個體間的差異。由于這些等位基因在人群中常見，故在腫瘤等疾病防治中意義重大。近有消息，國際學術界和公司協(xié)作繪制人類基因組變異圖譜，這將使發(fā)病和預防機制的研究進入分子水平。,2．心血管疾病 心血管疾病包括高血壓、冠心病和動脈粥樣硬

55、化等，其病因可能與多種因素，如飲食、緊張焦慮、遺傳等有關。而分子流行病學則進一步從基因水平對其病因進行研究。脂蛋白脂酶（LPL）能促進乳糜微粒和極低密度脂蛋白中甘油三酯（TG）分解，如果LPL活性降低，TG含量增高，高密度脂蛋白膽固醇（HDLL）降低，導致冠心病的產生。錢衛(wèi)沖等（1998年）對106例冠心病病例的病例對照研究發(fā)現(xiàn)，LPL PVU II（--）基因型和單倍體基因型H+P-是冠心病的危險因素，HDL-C和APO A/B是保護

56、因素，LPL PVU II（--）基因型與非LPL PVU II（--）基因型的OR值是17.18。H+P-基因型與非H+P-基因型OR值為3.67。 除腫瘤和心血管疾病外，分子流行病學還更廣泛研究其他慢性疾病，如糖尿病、自身免疫疾病等疾病的病因、高危人群的篩選及早期診斷等。,（四）在遺傳性疾病研究中的應用 分子流行病學在非傳染病研究中闡明遺傳易感性方面發(fā)揮了極大的作用。血管緊張素轉化酶基因（ACE）位于染色體17q23，

57、包括26個外顯子和25個內含子，16內含子中的一段287bp的插入/缺失（I/D）多態(tài)性，導致3種基因型：插入純合子型（II）、缺失純合子型（DD）和雜合子型（ID）。ACE基因缺失型與冠心病、心肌梗死等發(fā)病顯著相關。沈丹等（1998年）研究ACE基因多態(tài)性發(fā)現(xiàn)，高血壓合并腦梗死的DD基因型頻率29.6%及D等位基因頻率56.8%，都顯著高于正常組12.8%和46%，ACE基因缺失型可能是造成中國人高血壓合并腦梗死發(fā)病的重要遺傳易感因素

58、。遺傳易感因素的研究，為篩選高危人群提供了線索。,還有一些單基因遺傳性疾病更需要從群體遺傳學角度研究，其發(fā)病機理是單個基因或1對等位基因缺陷或發(fā)生突變所引起的，如果能從群體角度研究其遺傳規(guī)律，將有重要意義。視網(wǎng)膜母細胞瘤是單基因遺傳病，是由于位于13q14的Rb基因的突變或失活所致，目前公認生殖細胞起源的Rb基因的突變決定了患者發(fā)生視網(wǎng)膜母細胞瘤的遺傳易感性。黃倩等（1998年）檢測79個有Rb基因突變的視網(wǎng)膜母細胞瘤家系中，25例查出

59、體細胞起源的Rb基因突變，其余54例為生殖細胞起源的Rb基因突變，其中36例突變是新生的，15例突變由親代遺傳，3例為基因突變嵌合體。,（五）在疾病防治方面的應用 進行疫苗的預防接種，是保護易感人群最有效、最經(jīng)濟的方法。使用滅活或減毒活疫苗，存在免疫原性差、毒力回復，疫苗需冷凍或冷藏等缺點。利用分子生物學技術，將DNA重組，構建載體，利用細菌等表達大量的蛋白質作為疫苗，如目前廣泛應用的乙型肝炎（乙肝）疫苗，就是將乙肝表面抗原基因連接到

60、適當?shù)妮d體上，然后在酵母或哺乳動物細胞中表達而得到，通過基因工程生產的乙肝疫苗成本大大低于血源性乙肝疫苗。利用基因工程生產其他疫苗，痢疾、霍亂、瘧疾等亦受到人們關注?；蚬こ桃呙绲陌踩暂^滅活或減毒活疫苗提高，但由于基因疫苗大多為高度純化的小分子蛋白質或多肽，免疫原性差，免疫效果有時不理想。核酸疫苗是第三代預防接種用疫苗，該種疫苗是在質粒DNA上攜帶編碼特定抗原蛋白的基因序列，通過皮內或肌肉注射方式，進入體內。核酸疫苗無需復雜的純化過程

61、，可誘導機體產生細胞免疫和體液免疫反應，無需冷凍或冷藏，是有廣闊應用前景的疫苗。有關核酸疫苗目前大多在動物中進行，經(jīng)過安全、有效檢驗后，有望進行臨床試驗。,三、存 在問題和前景,（一）存在問題 1．分子流行病學亦存在流行病學的許多局限性，例如，因易受干涉或混雜因素的影響，可能產生誤導的結果。 2．和任何類型的生物監(jiān)測和篩查一樣，都具有潛在的社會傷害。目前采用的許多生物標記雖可用來評估

62、暴露、劑量和對被檢人群的潛在危險性，但不足以預測疾病，定量估計個體危險性，即使在研究較多的家庭性癌綜合征，遺傳學檢測已成為臨床處理的一部分，但作為常規(guī)的篩查和診斷還不能推薦，這是因為①即使癌高風險易感基因攜帶者，也因基因間及與宿主和環(huán)境因素間的相互作用，使個體危險性難以很好的確定；②對大部分家庭性遺傳性疾病，目前還缺少確切有效的干預或治療措施；③應有標準化的測試技術、質量控制和監(jiān)管。目前這方面尚不成熟；④測試前后應有恰當?shù)倪z傳咨詢；⑤應

63、重視遺傳學診斷的社會后果，在沒有得到社會普遍理解前，這種檢測除會給癌高危個體造成終生的精神壓力外，還可能給就業(yè)、人壽保險和正常生活帶來種種困擾，故應權衡利弊。當然，積極進行研究，作好檢測前后的遺傳咨詢和對結果的保密，不斷提高檢測、干預和治療的水平，解除這一部分疾?。ò└呶Ｈ巳旱纳硇耐纯?，還是十分緊迫和重要的任務。,3．較常見的易感基因多態(tài)性，多僅適用于某些特殊的暴露或某種類型的疾病，而且這方面的研究常出現(xiàn)矛盾的結果，如代謝酶遺傳多態(tài)性

64、對癌危險性的影響就是如此，可能原因是：①研究設計、方法標準化和數(shù)據(jù)處理不夠合理；②不同研究樣本種族構成和地理環(huán)境條件不同，這些易感基因的頻率、環(huán)境致癌因子的種類和量各不相同，它們相互作用后產生的危險性就更不同；③研究樣本量較小或易感基因型個體過少，影響統(tǒng)計效力；④基因多態(tài)性對癌易感性僅有中低程度的影響；⑤不同研究條件下混雜因素的影響等。,（二）前景 為促進分子流行病學、基因組流行病學研究的迅速而健康地發(fā)展，應克服上述存在問題和

65、把握基因組學研究的新成果，重點要抓住：①加強基礎、流行病學和醫(yī)學專家之間協(xié)作，取長補短，做好科研設計，提高實驗質量和結果分析水平；②應用人類基因組研究的新成果和生物芯片等新技術，發(fā)現(xiàn)和驗證與疾病易感性相關的更多遺傳多態(tài)，并開展蛋白質多態(tài)研究，深入研究它們之間及其與環(huán)境之間的交互作用，并闡明在個體疾病易感性中的作用；③我國學者應根據(jù)國情，對高發(fā)或呈上升趨勢的腫瘤、心血管疾病、糖尿病等，在現(xiàn)有研究基礎上應用現(xiàn)代技術，有重點地開展大規(guī)模前瞻性