細(xì)胞培養(yǎng)操作詳細(xì)

1、【細(xì)胞培養(yǎng)】一、細(xì)胞的復(fù)蘇：非原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般凍存于液氮之中，需要培養(yǎng)時(shí)要先從液氮中取出使之復(fù)蘇。細(xì)胞復(fù)蘇的原則——快速融化：必須將凍存在－196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。具體操作如下：1、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃，并將含10%FBS的培養(yǎng)液置于其中預(yù)熱；。1.2、用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。1.3、在超

2、凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。2、取出凍存管及迅速解凍：2.1、根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。2.2、從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。2.3、迅速將凍存管投入到已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化，約12min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。3、平衡離心將細(xì)胞懸液吸到離心管中，1000～1500rpm離心3

3、分鐘；4、制備細(xì)胞懸液吸去上清液，加入10ml培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，使細(xì)胞懸浮；5、細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度以5105ml為宜。6、培養(yǎng)細(xì)胞將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液吸到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（略微擰松培養(yǎng)瓶蓋），換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。通常，除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞），在解凍之后，可直接放入含有1015ml（5－10倍）新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中，待隔天再置換新

4、鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附的問(wèn)題。二、細(xì)胞的傳代：培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)至一定密度之后，由于培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)逐漸消耗、代謝物逐步積累（可見到培養(yǎng)液變黃），而且細(xì)胞的生長(zhǎng)空間也受到限制，就會(huì)影響到細(xì)胞的繼續(xù)生存。這時(shí)就需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過(guò)程就叫做傳代。1、貼壁細(xì)胞的傳代具體操作如下：1.1、傳代前準(zhǔn)備：1.1.1、預(yù)熱培養(yǎng)用液：把裝有培養(yǎng)液、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。1

5、.1.2、用75％酒精擦拭雙手和經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈工作臺(tái)1.1.3、正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。1.1.4、點(diǎn)燃酒精燈：注意火焰不能太小。1.1.5、準(zhǔn)備好將要使用的已滅菌的空培養(yǎng)瓶。1.1.6、取出已經(jīng)預(yù)熱好的培養(yǎng)用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。1.1.7、從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，注意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下觀察細(xì)胞，并做好記錄。分子結(jié)構(gòu)，以至于降低冷凍

6、保護(hù)效果。在常溫下，DMSO對(duì)人體有害，故在配制時(shí)最好戴上手套操作。2.2、不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～60℃這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。2.3、注意定期檢查液氮罐內(nèi)液氮量，及時(shí)添加。2.4、細(xì)胞在液氮中貯存的時(shí)間理論上是無(wú)限的。但為妥善起見，特別是很多未被凍存過(guò)的細(xì)胞在首次凍存后要在短期內(nèi)復(fù)蘇一次，觀察細(xì)胞對(duì)凍存的適應(yīng)性。已建系的細(xì)胞最好也每年取一支復(fù)蘇一次后，再繼續(xù)凍存。四、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)

7、待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。具體操作如下：1、準(zhǔn)備工作：取一瓶傳代的細(xì)胞，按上述二的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以使用。2、細(xì)胞懸液制備：細(xì)胞懸液的制備方法：用0.25％的胰蛋白酶液消化、PBS液洗滌后，加入培養(yǎng)液（或Hanks液或PBS等平衡鹽溶液），吹打制成待測(cè)單細(xì)胞懸液。3、細(xì)胞計(jì)數(shù)：2.1、蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽

8、上。2.2、制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸適量細(xì)胞懸液（如5滴）到一離心管中，加入等體積臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。若僅是單純的進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，不考慮細(xì)胞的活力，則可省略臺(tái)盼藍(lán)染色步驟。2.3、、將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。2.4、統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)

9、：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大格（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒(méi)有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。2.5、計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）ml＝（四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)4)2104說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm（長(zhǎng)）1.0mm（寬）0