tunel法檢測細胞凋亡實驗原理和方法

1、TUNELTUNEL法檢測細胞凋亡實驗原理和方法法檢測細胞凋亡實驗原理和方法細胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個漸進的分階段的過程，染色體DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca和Mg依賴的核酸內切酶作用下，在核小體單位之間被隨機切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現缺口而產生的一系列DNA的3’OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（Td

2、T）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3’末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進行缺口翻譯（nicktranslation），使低分子量的DNA標記或染色，然后分析凋亡細胞。TU

3、NEL或缺口翻譯法實際上是分子生物學與形態(tài)學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細胞和從組織中分離的細胞的細胞凋亡測定，并可檢測出極少量的凋亡細胞，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學測定法要高，因而在細胞凋亡的研究中已被廣泛采用。一、過氧化物酶標記測定法原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）11d

4、UTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細胞雙鏈或單鏈DNA的3OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產生很強的顏色反應，特異準確的定位出正在凋亡的細胞，因而可在普通光學顯微鏡下進行觀察。毛地黃植物是地高辛的唯一來源。在所有動物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結合的配體，因而非特異性反應很低?？沟馗咝恋奶禺愋钥贵w與脊椎動物甾體激素的交叉反應不到1

5、％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細胞Fc受體非特異性的吸附作用。本方法可以用于福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細胞凋亡測定。檢測晚期凋亡。基本原理：對不同組織切片先增加細胞膜通透性，然后讓rTDT和bio標記的dTUTP進入細胞內，在rTDT的輔助下dTUTP與核斷裂的DNA3’OH結合，再用HRP標記的鏈霉親和素與dTUTP上biotin結合（每個鏈霉親和素至少可以再結合

6、3個biotin分子），最后用DAB、過氧化氫與SP上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應，形成苯乙肼聚合物而呈現棕褐色，最終通過計數每張切片上不同視野中TUNEL陽性細胞的比例來判斷細胞凋亡發(fā)生情況。羅氏試劑盒一、試劑1、酶濃縮溶液550μl——末端脫氧核糖核酸轉移酶（10）試劑2、標記溶液5550μl——含有核苷酸混合液的反應液（1）試劑3、轉化劑POD3.5ml——酶標記抗熒光素抗體（即用型，融后4℃保存）二、所需的溶液和儀器

7、10mMTrisHCl（pH7.4~7.8）、PK配制、DAB、飯盒、吹風機、3%H2O2甲醇溶液、PBS、蓋玻片、中性樹膠、蘇木素、二甲苯和無水乙醇（用量多）、雙蒸水（用以配梯度酒精）1充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60度20min，石蠟切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min5；②3%過氧化氫甲醇中浸洗1015min，抑制內源性過氧化氫酶。③用蛋白酶K（20μgml溶于TrisHC

8、l中，pH7.4~8.0）室溫孵育15~30分鐘。④PBS洗約5min2次，擦干樣品周圍的水。此階段配制TUNEL反應混合物——從試劑2中取出100μl標記溶液作為兩個陰性對照；將試劑1中取5μl試劑2中45μl標記液中，配成50μlTUNEL反應混合物混勻（即配即用，4℃避光?。輼擞浄磻旱渭?0μl的TUNEL反應混合液，在濕盒中37℃孵育60分鐘（為防蒸發(fā)和保證TUNEL反應混合物均勻分布，可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS洗

9、5min3次，至此樣品可在熒光鏡下（綠色）分析結果。⑥信號轉化和分析：擦干樣品周圍的水分，加入50ul轉化劑POD，濕盒中37℃孵育20~30分鐘（可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS洗5min3~5次⑦加入50~100μlDAB底物溶液，室溫（10~25℃）孵育5~10min，PBS洗5min3次。（蘇木素染13秒，以免視野全染，需要摸索條件）⑧中性樹膠或者甘油封片（在封片前可以復染），光鏡下分析結果。?穩(wěn)定性：TUNEL反應混合物需

10、在使用前立即制備，不能儲存，配好的此液體必須將放入冰浴中。2、轉化劑POD（即用型）：一旦融化此液體，需在4℃保存（最多保存6個月），并且不能反復凍存。蛋白酶K一般工作液濃度為20ugml但濃縮液可配制1~10mgml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100mMTrisHClPH8.050mMEDTA）；注意：1)蛋白酶K可以幫助滲透組織，但延長孵育時間可能導致切片脫落（comeofftheslide）所以要最優(yōu)化孵育時間長短。時

11、間一般為10~30min，4um左右的片子可以用10min，但30um左右的可用30min，最終通過摸索最佳時間。過長易脫片、過短起不到通透效果。2)對于比較困難的組織，可以選用0.1MpH6.0的枸櫞酸鹽緩沖液進行修復（石蠟切片無必要用），200ml需350W修復5min3)對照：陰性對照：經過固定和通透的細胞樣品加入50μl試劑2以代替TUNEL反應混合物，從標記步驟以下同上。陽性對照：經過固定和通透的細胞樣品用細球菌的核酸酶或DN

12、aseI使之產生DNA鏈缺口，從標記步驟以下同上。4)操作流程：常規(guī)脫蠟、脫水處理——沖洗樣品——滴加TUNEL反應混合物，37℃孵育60分鐘——沖洗樣品——選擇：熒光鏡下觀察分析——滴加轉化劑POD，37℃孵育30分鐘——洗樣品——滴加DAB底物溶液，室溫孵育520分鐘——光鏡下分析結果5)假陽性多的原因有很多：POD封閉不全、DAB顯色時間過長等原因假陽性嚴重，可能原因應該是DAB孵育時間過長，建議首先排除之，同時加強PBS浸洗6)

13、DAB顯色時間:（1）DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現淺棕色本底時即可沖洗；（2）DAB顯色時間很短（如幾秒或幾十秒）就出現很深的棕褐色，這很可能說明你的抗體濃度過高或抗體孵育時間過長，需要下調抗體濃度或縮短你的抗體孵育時間；（3）此外，若很短時間就出現背景很深，還有可能你前面的封閉非特異性蛋白不全，需要延長封閉時間；（4）DAB顯色時間很長（如超過十幾分鐘）才出現陽性染色，一方面可能說明你的抗體濃度過低或孵

14、育時間過短（最好一抗4度過夜）；另一方面就是封閉時間過長。7)脫片產生的原因和如何防止脫片:（1）多聚賴氨酸玻片質量的問題。我原先是買的，邁新按說也是不錯的，可是都脫成什么樣子了。后面補做第二批時用的病理科老師自己做的片子，要好一點。（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。（3）組織的問題，越是有壞死之類越容易脫。（4）沒烤好，時間短溫度不夠之類。（5）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑