hbv、hcv高精度核酸檢測技術的臨床意義_第1頁
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文檔簡介

1、肝炎病毒PCR檢測技術國內現(xiàn)狀及最新進展 暨HBV/HCV高精度核酸檢測技術的臨床意義,主要內容,Part Ⅰ 熒光定量PCR技術簡介Part Ⅱ HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展Part Ⅲ 臨床對HBV/HCV檢測技術的需求Part Ⅳ HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,Part Ⅰ PCR技術簡介,病原學檢測常用的實驗室技術 ☆ 細胞培養(yǎng)與鑒定

2、(“金標準”)、動物實驗 ☆ 血清學、免疫學診斷技術 ☆ 電鏡技術 ☆ 分子生物學診斷技術——PCR,PCR技術簡介,多聚酶鏈式反應(PCR:Polymerase Chain Reaction),Polymerase: DNA聚合酶,PCR技術簡介,核裂變鏈式反應,“鏈式反應”改變世界,,,PCR技術簡介,PCR技術的誕生,Kary B. Mullis(穆利斯(美)),1971:Khorana等提出在

3、體外經DNA變性、引物 雜交,再用DNA聚合酶延伸DNA的設想。1983:Mullis發(fā)明了PCR技術,使Khorana的設想得到實現(xiàn)。1988:耐熱DNA聚合酶(Taq)引入了PCR技術 1993:Mullis榮獲1993年度諾貝爾化學獎。,PCR技術簡介,Kary B. Mullis(1944-),http://www.karymullis.com,The New York Times as "hi

4、ghly original and significant, virtually dividing biology into the two epochs of before P.C.R. and after P.C.R.",PCR技術簡介,PCR技術簡介,PCR原理:實質就是體外基因復制技術,PCR技術簡介,30次循環(huán)后靶序列擴增的數(shù)量,10億,PCR技術分類,常規(guī)PCR 在PCR結束后對終點產物進行分析。

5、 巢式PCR 多重PCR PCR結合限制性長度多態(tài)性分析(PCR-RFLP) PCR結合特異性寡合苷酸探針斑點雜交(PCR-ASO) PCR結合變性梯度凝膠(PCR-DGGE) PCR結合的單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)等分析技術,熒光定量 PCR(real-time PCR) 通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針,對PCR產物進行標 記跟蹤,實時在線

6、監(jiān)控反應過程,結合相應的軟件可以對結果進行分析,計算待測樣品的初始模板量。 實時檢測PCR擴增,在擴增的指數(shù)期對起始模板進行定量。,PCR技術簡介,熒光定量實時PCR與普通PCR的比較實時在線監(jiān)控 對樣品擴增的整個過程進行實時監(jiān)控,能夠實時地觀察到產物的增加,直觀地看到反應的對數(shù)期降低反應的非特異性 使用引物和熒光探針同時與模板特異性結合,提高了PCR反應的特異性增加定量的精確性

7、 全程監(jiān)控,準確的算法進行定量結果分析更加快捷方便,無需跑膠,PCR技術簡介,1、目的基因的克?。? PCR技術為在重組DNA過程中獲得目的基因片段提供了簡便快速的方法。2、基因的體外突變:   可以隨意設計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。,PCR的應用,3、DNA和RNA的微量分析:   PCR技術高度敏感,對模板DNA的含量要求很低,是DNA和RNA微量分析的最好方法。實際工作中,一滴血液、一

8、根毛發(fā)或一個細胞已足以滿足PCR的檢測需要,因此在基因診斷方面具有極廣闊的應用前景。4、基因轉錄水平檢測   RT-PCR可檢測不同組織或細胞中基因的轉錄水平5、基因突變分析:   利用PCR與一些技術的結合可以大大提高基因突變檢測的敏感性。,PCR技術簡介,Part Ⅱ HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,乙型肝炎檢測標志物☆ HBsAg, 抗-HBs,☆ HBeAG,抗-HBe

9、,☆抗-HBc(IgG,IgM),☆ HBV-DNA,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,☆ 免疫學檢測 ☆ 生物化學檢測 ☆ 組織學檢測 ☆ 分子生物學檢測 ☆ 基因芯片,乙肝病毒的檢測方法,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,HBV分子生物學檢測☆ HBV-DNA☆ 基因耐藥突變檢測☆ 基因分型☆ HBVcccDNA☆ HBV前C及核心啟動子

10、變異,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,HBV分子生物學檢測方法及臨床意義,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,HBV分子生物學檢測方法及臨床意義,HCV的感染模型,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,丙肝病毒的檢測方法,☆ 血清生化學檢測☆ HCV抗體檢測☆ HCV核心抗原檢測☆ HCV RNA 檢測,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,HCV分子生物學檢測方法及臨床意義,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展

11、,目前國內外乙肝主流基因診斷技術比較,除個別公司產品外,國內的檢測技術在方法學、靈敏度以及準確性方面一般都遠遠落后于發(fā)達國家,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,常用DNA類標本處理方法,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,常用RNA類標本處理方法,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,高靈敏度的磁珠核酸純化方法的比較,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,(圣湘)磁珠法HBV產品與國內外主流產品的比較,,,,,HBV/HCV核酸檢

12、測技術現(xiàn)狀及進展,圣湘磁珠法HCV產品與國內外主流產品的比較,25 IU/ml,,,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,不同方法的HBV DNA檢測下限以及不同標準要求,,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,☆國內大部分檢測試劑靈敏度≥1000Copies/ml,特異性、準確性等方 也存在著嚴重缺陷,遠遠不能滿足臨床檢測和用藥監(jiān)控的需求,這也是國內HCV研究進展緩慢的重要原因之一。,,HBV/HCV核酸檢測技術現(xiàn)狀及進展,Part

13、Ⅲ 臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,“2008年美國肝病協(xié)會CHB防治指南”:持久消除HBV是乙肝的治療終點,HBV DNA病毒載量盡可能小于或等于10 IU/ ml。,臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,“歐洲肝病研究學會EASL2010年指南”指出:采用熒光實時PCR方法檢測HBV DNA時,其靈敏度要小于或等于10-15 IU/ ml。,臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,“歐洲肝病研究學會EASL2011指南”還指出:丙

14、肝患者治療的終點是HCV RNA病毒載量低于50 IU/ ml。,臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,研究表明國產PCR試劑的靈敏度很難達到上述要求,五種乙型肝炎病毒核酸熒光定量檢測試劑盒的比較,中華傳染病雜志,2009年 第3期 ——吳星,黃維金, 周誠 ,莊輝 等(中國藥品生物制品檢定所,北京大學醫(yī)學部),臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,國內行業(yè)指導原則,國家SFDA技術審評中心《HBV DNA定量試劑技術審評指導原則》

15、中指出: HBV DNA最低檢測限應 ≤30IU/ml,臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,國產很多乙肝PCR試劑的靈敏度為500IU/ml至1000IU/ml之間,丙肝試劑的靈敏度為在1000IU/ml以上。從病毒性肝炎的早期診斷及適時確定治療終點的臨床需求看,現(xiàn)有的國產PCR試劑需要提高檢測靈敏度。,國內現(xiàn)狀,臨床對HBV/HCV檢測技術的需求,Part Ⅳ HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,HB

16、V DNA基線水平較高增加肝硬化和肝癌的風險,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,持續(xù)高HBV DNA水平和肝癌發(fā)病增加相關,,,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,,高HBV DNA水平預示長期肝相關死亡率風險,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,乙肝的治療,慢性乙肝的診斷1. HBsAg持續(xù)陽性6個月以上2. HBV-DNA高于105拷貝/毫升3. ALT持續(xù)升高或反復升高 

17、;慢性乙肝的分類1. HBeAg陽性乙肝:HBsAg、HBeAg陽性; HBV-DNA高于105拷貝/毫升;ALT持續(xù)升高或反復升高2. HBeAg陰性乙肝:HBsAg、anti-HBe陽性; HBV-DNA高于104拷貝/毫升;ALT持續(xù)升高或反復升高 慢性乙肝治療的目標病毒抑制:表現(xiàn)為HBeAg血清轉換和HBV-DNA陰轉肝損傷程度降低:表現(xiàn)為轉氨酶恢復正常完全清除病毒:表現(xiàn)為HBsAg消失,HBsAb出現(xiàn)

18、,血清和肝細胞中檢測不到HBV-DNA,從目前水平來看,不可能完全清除病毒,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,臨床檢測HBV DNA啟動抗病毒治療,連續(xù)定量HBV DNA是病人治療前評估的關鍵!,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,ALT:谷丙氨酸轉氨酶ULN:正常值的上限LT:肝移植,慢性乙型肝炎HBeAg陽性病人治療指南(亞太肝病研究會2008年),HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,

19、慢性乙型肝炎HBeAg陰性病人治療指南,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,慢性乙型肝炎肝硬化病人治療指南,ETV:恩替卡韋LAM:拉米夫定Ldt:替比夫定ADV:阿德福韋,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,上圖為采用羅氏公司Cobas Taqman/Amplicor HBV DNA定量PCR試劑時治療路線圖,替比夫定治療慢性乙型肝炎中國路線圖,,,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,部

20、分HBV DNA定量試劑檢測性能比較,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,注:檢出限為100Copies/ml,慢性丙肝治療建議 由亞太地區(qū)肝病學會(APASL)、美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)、歐洲肝病學會(EASL)等發(fā)表的有關丙型肝炎的診療指南或專家共識中指出:目前對丙肝最有效的治療是聚乙二醇化干擾素α聯(lián)合利巴韋林。,治療應答的定義及描述,HBV/HCV高精度檢測技術對肝病診療的臨床意義,HCV RNA基因為

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