硼替佐米對伯基特淋巴瘤raji的體外治療作用

1、硼替佐米對伯基特淋巴瘤Raji的體外治療作用李靖1，閆明明21.河南省洛陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南洛陽，4710022.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南洛陽，471002摘要：【目的】探究硼替佐米對伯基特淋巴瘤Raji細胞體外治療作用及其可能機制?！痉椒ā縈TT實驗檢測硼替佐米對淋巴瘤Raji細胞活力的影響；Westernblotting實驗和RTPCR實驗檢測硼替佐米對Raji細胞中NFκBp65表達和Caspase3剪切的影響?！窘Y(jié)果】MT

2、T實驗表明硼替佐米抑制Raji細胞活力，并且其抑制作用呈劑量、時間依賴性（P0.05）；Westernblotting實驗和RTPCR實驗顯示硼替佐米顯著抑制Raji細胞NFκBp65表達并且促進caspase3的剪切（P0.05）。【結(jié)論】硼替佐米能夠抑制Raji細胞增殖，機制可能與抑制NFκB（P65）激活和上調(diào)cleavedcaspase3表達有關(guān)。【關(guān)鍵詞】硼替佐米；淋巴瘤；NFκBThetherapeuticeffectofB

3、urkittbtezomibonlymphomaRajiinvitroLiJing1YanMingming21:LuoyangVocationalCollegeofTechnologyLuoyang471002China2:FirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceTechnologyLuoyang471002ChinaAbstract:Objective:Toexplethera

4、peuticeffectofbtezomibonBurkittlymphomaitspossiblemechanism.Methods:TheeffectofbtezomibonhumanlymphomaRajicellsproliferationwasdeterminedbyMTTassay.TheexpressionofNFκBp65Cleavedcaspase3proteinweredetectedbyWesternblottin

5、g.NFκBp65Cleavedcaspase3mRNAexpressionweredetectedbyRTPCR.Results:ThedatashowedthatbtezomibinhibitedRajicellsproliferationtheinhibitionratewererelatedinadosedependentmanneratimedependentmanner(P0.05).Westernblottingdatai

6、ndicatedthattheexpressionofNFκBp65wasdecreasedtheexpressionofCleavedcaspase3wasincreasedafterbtezomibtreatmentinadosedependentmanner(P0.05).RTPCRdatademonstratedthatthemRNAexpressionofNFκBp65wasdecreasedthemRNAexpression

7、ofCleavedcaspase3wasincreasedafterbtezomibtreatmentinadosedependentmanner(P0.05).Conclusions:BtezomibcaninhibitGTTTGAGGACCTTCGACCAG3’，reverse：5’CAAAGATGTCGTCCAGGGTC3’；GAPDH引物序列：fward：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，reverse：5’TC

8、CACCACCCTGTTGCTGTA3’。1.3細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)人淋巴瘤細胞株Raji細胞培養(yǎng)于37℃、含有5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，其培養(yǎng)基是含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，并且向培養(yǎng)基加入青霉素鏈霉素雙抗。分別向Raji細胞培養(yǎng)基中加入生理鹽水溶解的硼替佐米，硼替佐米最終濃度分別為0、5、10、20和50nmolL（nM）1.4方法方法1.4.1MTT方法檢測方法檢測Raji細胞株活力細胞株活力將Raji細胞接種到96孔

9、板中，每孔接種1104個Raji細胞，在37℃、含有5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，分兩組實驗。一組與不同濃度硼替佐米（0、5、10、20和50nM）共同孵育24h，每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔；另外一組是用10nM硼替佐米與Raji細胞分別孵育24h、48h和72h，每個時間點設(shè)置4個復(fù)孔。之后每個組加入20μlMTT工作液，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸出培養(yǎng)基，加入200μlDMSO，搖床搖晃10min充分溶解結(jié)晶物。將96孔板蓋打開

10、，放入酶標儀檢測，在波長490nm處檢測OD值，并做記錄。，以上實驗重復(fù)3次。1.4.2Westernblotting實驗實驗按照實驗要求用不同濃度硼替佐米（0、5、10、20和50nM）處理Raji細胞24h后，PBS洗滌細胞，加入細胞裂解液RIPA（其中含有蛋白酶抑制劑1:1000），冰上裂解30min，收集蛋白。離心（4℃，12000gmin）15min。BCA蛋白定量試劑盒定量后調(diào)整各組蛋白上樣總量至30μg。SDS聚丙烯酰胺凝

11、膠電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)到PVDF上。室溫5%牛奶封閉1h。TBST洗膜3次，每次5min。加入NFκBp65抗體(1:2000稀釋)、Cleavedcaspase3抗體(1:1000稀釋)和GAPDH抗體(1:5000稀釋)4℃下孵育過夜。TBST洗膜3次，每次5min。孵育相應(yīng)的二抗(1:1000稀釋)，TBST洗膜3次，每次10min。加ECL發(fā)光液顯影，用自動顯影儀顯影，并分析條帶灰度。用自帶軟件掃描灰度值。1.4.3RTPCR檢測