環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、環(huán)境毒理學(xué)實(shí)驗(yàn),授課教師：蘇增建試驗(yàn)地點(diǎn)：環(huán)境毒理實(shí)驗(yàn)室適用專業(yè)：環(huán)境科學(xué)相關(guān)專業(yè),實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),一、目的與要求（1）學(xué)習(xí)和掌握濾紙接觸毒性實(shí)驗(yàn)和人工土壤實(shí)驗(yàn)的基本原理和方法。（2）初步了解評(píng)價(jià)環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)對(duì)土壤中動(dòng)物急生傷害的標(biāo)準(zhǔn)和基本步驟。,二、原理濾紙接觸法毒性實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單易行，可對(duì)受試物毒性進(jìn)行初篩。將蚯蚓與濕潤(rùn)的濾紙上的受試物接觸，測(cè)定土壤中受試物對(duì)蚯蚓的潛在影響。人工土壤實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)將蚯蚓置于含不同濃度受試

2、物的人工土壤中，飼養(yǎng)7d和14d，評(píng)價(jià)其死亡率，評(píng)價(jià)受試物對(duì)蚯蚓的急性毒性作用。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),三、設(shè)備與材料1、主要儀器和設(shè)備玻璃容器：平底玻璃管（3cm×8cm）培養(yǎng)裝置：光強(qiáng)400-800 lx的溫控培養(yǎng)箱中性濾紙：80-85g/m2移液器、塑料薄膜、烘箱、電吹風(fēng),實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),2、試驗(yàn)生物選用二月齡以上，體重300-500mg左右的健康赤子愛(ài)勝蚓。實(shí)驗(yàn)前應(yīng)

3、在實(shí)驗(yàn)室條件下馴養(yǎng)2周以上。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),3、人工土壤人工土壤基質(zhì)組成（干重）：（1）10%干牛糞（PH為5.5-6.0，磨細(xì)，風(fēng)干，測(cè)定含水量）；（2）20%高嶺黏土（含50%以上高嶺土）；（3）70%石英沙（0.05-0.2mm粒徑的石顆粒50%以上）；（4）混合人工土壤的組成成分，加入蒸餾水使其含水量為干重的25%-42%，混合均勻。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),四、方法和步驟1、清腸用蒸餾水清洗蚯蚓，然

4、后置于鋪有濾紙的磁盤(pán)上清腸24h，用去離子水沖洗后，濾紙吸干稱重，供試。注：清腸過(guò)程用薄膜包緊磁盤(pán)，防止蚯蚓爬出磁盤(pán)死亡。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),2、濾紙實(shí)驗(yàn)在平底試管內(nèi)壁襯濾紙，鋪滿不重疊；設(shè)5個(gè)濃度梯度（見(jiàn)附表）及對(duì)照共6組試管，每組≥10個(gè)重復(fù)，每個(gè)試管內(nèi)首先移取1ml對(duì)應(yīng)濃度的受試物溶液，用潔凈空氣吹干，然后每個(gè)試管加入1ml去離子水，然后加入1條蚯蚓，用薄膜封口，在黑暗、20±2℃環(huán)境培養(yǎng)48h，每24h觀

5、察一次，記錄死亡情況，同時(shí)還有蚯蚓的病理癥狀和行為。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),選擇濃度范圍的預(yù)試驗(yàn),注：受試物溶于水（≥1000mg/l）或丙酮等助溶劑，配成系列濃度,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),3、人工土壤試驗(yàn)正式試驗(yàn)前，需進(jìn)行濃度范圍選擇實(shí)驗(yàn)。最終設(shè)定至少5個(gè)濃度梯度級(jí)及空白組，濃度范圍應(yīng)包括最大耐受濃度和致死濃度兩組濃度，每組至少有4個(gè)平行樣。受試蚯蚓需在人工土壤中先馴養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)前沖洗干凈。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行14d，每7d觀察蚯蚓

6、的病理癥狀及行為、死亡。測(cè)定介質(zhì)中的含水量。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),4、質(zhì)量控制可在實(shí)驗(yàn)中加入陽(yáng)性對(duì)照組（氯乙酰胺），空白組用去離子水代替受試物，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后空白對(duì)照組死亡率應(yīng)不超過(guò)10%。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),五、結(jié)果及實(shí)驗(yàn)報(bào)告記錄不同受試物濃度對(duì)應(yīng)的死亡情況，實(shí)驗(yàn)報(bào)告就包括以下內(nèi)容：受試物的基本物化性質(zhì)；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)條件等；試驗(yàn)條件包括溫度、濕度、光照條件、實(shí)驗(yàn)介質(zhì)的成分級(jí)成和制備條件；實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告。,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急

7、性毒性實(shí)驗(yàn),六、注意事項(xiàng)1、牛糞與其他人工土壤成分混合前應(yīng)充分磨細(xì)風(fēng)干、烘干，測(cè)定含水量；2、蚯蚓馴養(yǎng)條件：溫度18-22 ℃，持續(xù)光照（強(qiáng)度400-800 lx ），保證濕度；,實(shí)驗(yàn)一 蚯蚓急性毒性實(shí)驗(yàn),3、實(shí)驗(yàn)中管口或瓶口必須用薄膜封緊并保證通氣，防止蚯蚓鉆出；4、根據(jù)LC50值可將農(nóng)藥對(duì)蚯蚓的毒性劃分三個(gè)等級(jí)：10ppm的為低毒農(nóng)藥,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶活性的抑制,一、目的與要求1、了解有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑共同的特性，即

8、對(duì)昆蟲(chóng)或高等動(dòng)物體內(nèi)膽堿酯酶的活性能起抑制作用，而引起動(dòng)物中毒死亡。2、利用這一原理測(cè)定各種有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑在動(dòng)、植物體內(nèi)的殘留毒性，為安全使用農(nóng)藥提供依據(jù)。,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),二、原理當(dāng)高等動(dòng)物或昆蟲(chóng)被有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑作用之后，體內(nèi)膽堿酯酶就受抑制，不能繼續(xù)起水解作用，因此，它們體內(nèi)的乙酰膽堿大量積累，而導(dǎo)致中毒死亡,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),三、設(shè)備與材料1、設(shè)備：可見(jiàn)光分光光度計(jì)；試管13支，移液

9、器；振蕩水浴鍋，燒杯，研缽。2、試劑：（1）0.004M溴化或氯化乙酰膽堿；（2）2M鹽酸羥胺溶液；（3）3.5N NaOH；（4）4N鹽酸溶液；（5）0.37M三氯化鐵溶液。,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),四、步驟與方法1、將臺(tái)面的大試管進(jìn)行編號(hào)1-9（其中6號(hào)管為空白管，9號(hào)管為對(duì)照管），另有一支2ml有蓋管；2、每一排所有組將芽蟲(chóng)放在一起，加入5倍左右的冷凍蒸餾水，進(jìn)行研磨，然后將漿液全部倒入離心管中，在2500

10、rpm離心15min，取離心管中上清液作為正常蟲(chóng)漿，共用；,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),3、各小組向2ml管加入0.5ml正常蟲(chóng)漿，然后由老師幫忙加入20µl0.1%敵百蟲(chóng)液，放置15分鐘；4、向1-6號(hào)管分別添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.0ml試劑（1），再分別加入1.3、1.1、0.9、0.7、0.5、0.5磷酸鹽緩沖液，搖勻；向7號(hào)管中分別加入0.5ml無(wú)處理的正常蟲(chóng)漿，向8號(hào)管中加入0.

11、5ml敵百蟲(chóng)處理過(guò)的蟲(chóng)漿，然后分別向7-9號(hào)管加入1ml試劑（1），搖勻；,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),5、將6-9號(hào)管放入37℃振蕩水浴鍋中，40min后取出；6、向6號(hào)管中加入1ml試劑（4），搖勻后；7、分別向1-9號(hào)管中加入2ml試劑（2）與試劑（3）的混合液（1：1臨時(shí)配用），大力搖動(dòng)1min以上；,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),8、向9號(hào)管中加入0.5ml正常蟲(chóng)漿；9、除6號(hào)管外，分別向各管（1-

12、5號(hào)、7-9號(hào)）加入1ml試劑（4），搖勻；10、向1-9號(hào)管加入1ml試劑（5），各管即呈現(xiàn)深淺不同的紅棕色，用可見(jiàn)光光度計(jì)（540nm進(jìn)行測(cè)定）。,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),五、結(jié)果與報(bào)告要求作出乙酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)這條標(biāo)準(zhǔn)曲線求出樣本所含的乙酰膽堿量，從而計(jì)算出膽堿酯酶被抑制的百分率。,實(shí)驗(yàn)二 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制實(shí)驗(yàn),六、注意事項(xiàng)1、受試生物如果是荔枝蝽，則需雄雌各3頭，實(shí)驗(yàn)時(shí)需去除雄性的睪丸，剪去翅