食物中毒性細(xì)菌及其檢驗(yàn)

1、食物中毒性細(xì)菌及其檢驗(yàn),食品藥品學(xué)院微生物課程組,,,內(nèi)容提要,沙門(mén)氏菌檢測(cè) 大腸菌群及大腸桿菌檢測(cè) 副溶血性弧菌 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 志賀氏菌 金黃色葡萄球菌檢測(cè) 肉毒梭菌 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌 檢測(cè)等,食物中毒(food poisoning)是指攝入了含有生物性、化學(xué)性有毒有害物質(zhì)的食品或者把有毒有害物質(zhì)當(dāng)作食品攝人后出現(xiàn)的非傳染性(不屬于傳染病)的急性、

2、亞急性疾病。包括食入被污染的食物或腐敗變質(zhì)的食物；飲用含有大量化學(xué)毒物或病原微生物的水，或用這種水烹調(diào)加工的食物等。,第一節(jié) 食物中毒概述,注： 對(duì)于攝入非可食狀態(tài)的食物(未成熟的水果、蔬菜)，非正常數(shù)量的食物(暴飲、暴食)，以及某些食物雖可引起疾病，其臨床癥狀與食物中毒類似，但不屬于食品中毒的范圍。,食源性疾病的概念具有三個(gè)基本要素：食物是傳播病原物質(zhì)的媒介、引起食源性疾病的病原物質(zhì)是食物中的各種致病因子、主要臨床癥狀表現(xiàn)為中

3、毒性或感染性。美國(guó)FDA對(duì)食源性疾病的定義是指由于食用受污染的食品或者飲料而引起的疾病。WHO則將其定義為“凡是通過(guò)攝食 進(jìn)入人體內(nèi)的各種致病因子引起的、 通常具有感染性質(zhì)或中毒性質(zhì)的一 類疾病”。,食物被某些病原微生物污染進(jìn)食被毒物污染的食品食物本身含有天然有毒成分?jǐn)z入外形與普通食物相似，而實(shí)際含有毒成分的某些動(dòng)植物此外，在食品中濫加營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)人體也有害食物發(fā)生生物性或物理

4、化學(xué)性變化而產(chǎn)生或增加了有毒物質(zhì),食物中毒的來(lái)源,潛伏期短，發(fā)病過(guò)程急劇所有病人都有類似的臨床表現(xiàn)，且多表現(xiàn)為腸胃炎的癥狀有明顯的季節(jié)性。夏、秋季多發(fā)生細(xì)菌性和有毒動(dòng)植物食物中毒，冬、春季多發(fā)生肉毒中毒和亞硝酸鹽中毒等。發(fā)病率高且集中，人與人之間不直接傳染發(fā)病與進(jìn)食同類食物有明顯的因果關(guān)系,食物中毒的特征,對(duì)酶系統(tǒng)的干擾對(duì)血紅蛋白運(yùn)氧功能的阻斷對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)的干擾變態(tài)與光毒反應(yīng),食物中毒的機(jī)理,細(xì)菌性食物中毒的致病菌。包括沙門(mén)

5、氏菌、致病性大腸埃希氏菌、變形桿菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟樣芽孢桿菌、空腸彎曲桿菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、椰毒假單胞菌酵米面亞種、單核細(xì)胞增生李斯特菌等。在食物中產(chǎn)生大量毒素而引起。包括由黃曲霉毒素、鐮刀菌毒素、黃變米毒素、展青霉毒素、雜色曲霉毒素、棕曲霉毒素、交鏈孢霉毒素等；真菌毒素食物中毒如赤霉病麥面、霉變甘蔗中毒，霉變花生或玉米中毒等。,微生物性食物中毒的類型,第二節(jié) 食物中毒性細(xì)菌及

6、其檢驗(yàn),I 沙門(mén)氏菌屬,1880年E. Berth首先發(fā)現(xiàn)傷寒沙門(mén)氏菌，1885年Salmon與Smith又分離出豬霍亂沙門(mén)氏菌，以后取Salmon氏之名為本菌屬之名。沙門(mén)氏菌屬是一群符合腸桿菌科定義并與其血清學(xué)相關(guān)的革蘭氏陰性、需氧性、無(wú)芽孢桿菌。本菌屬種類繁多，抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)2300多個(gè)血清型我國(guó)已發(fā)現(xiàn)血清型近200個(gè)。它是引起食物感染與食物中毒的重要致病菌，是最常見(jiàn)的食源性疾病的病原微生物。,沙門(mén)氏菌屬——生物學(xué)特

7、性,形態(tài)特征： 革蘭氏陰性，大小為1~3×0.4~0.9μm的兩端鈍圓的短桿菌，無(wú)芽孢，一般無(wú)莢膜，除雞沙門(mén)氏菌和雛沙門(mén)氏菌以外，都有周身鞭毛，運(yùn)動(dòng)力強(qiáng)。,培養(yǎng)特性：沙門(mén)氏菌需氧或兼性厭氧，10-42 ℃都可生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為37℃，最適pH為6.8~7.8。營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板：35~37℃培養(yǎng)18~24h，其菌落大小一般為2~3mm，光滑、濕潤(rùn)、無(wú)色、半透明、邊緣整齊S.S瓊脂：沙門(mén)氏菌不分解乳糖，形成無(wú)色或淺粉

8、紅色、半透明的圓形菌落。產(chǎn)生硫化氫的菌株，菌落中心呈黑色。血平板：中等大小的灰白色菌落。,生化特性：絕大多數(shù)沙門(mén)氏菌有規(guī)律的發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但也有不產(chǎn)氣者，不發(fā)酵蔗糖和側(cè)金盞花醇、不產(chǎn)生吲哚、不分解尿素。,,沙門(mén)氏菌屬——生物學(xué)特性,沙門(mén)氏菌屬的抗原,菌體抗原（O抗原）表面抗原（K抗原）：Vi抗原和M抗原鞭毛抗原（H抗原）纖毛抗原,引起中毒的必要條件是食物中含有大量活菌.一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)食物中含菌量在105～108 cfu/

9、g范圍可引起食用者中毒。食入致病力強(qiáng)的沙門(mén)氏菌2×105cfu/g即可發(fā)病，致病力弱的沙門(mén)氏菌108cfu/g才可發(fā)病。,中毒的原因,中毒的機(jī)理,一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)沙門(mén)氏菌隨食物進(jìn)入消化道后，可在小腸和結(jié)腸內(nèi)繼續(xù)繁殖，附于腸黏膜或侵入黏膜下層，引起腸黏膜的充血、水腫、組織炎癥，經(jīng)淋巴系統(tǒng)進(jìn)入血液，出現(xiàn)菌血癥，引起全身感染。,胃腸炎型：最常見(jiàn)，約占75％。多由鼠傷寒、豬霍亂及腸炎沙門(mén)氏菌引起。多數(shù)起病急驟類傷寒型：多由豬霍亂及鼠傷寒

10、沙門(mén)氏菌所引起。潛伏期平均3～10d敗血癥型：常見(jiàn)的致病菌為豬霍亂或鼠傷寒沙門(mén)氏菌。多見(jiàn)于嬰幼兒兒童感冒型：霍亂型：可出現(xiàn)嚴(yán)重脫水以至循環(huán)衰竭。,中毒的癥狀,預(yù)防中毒措施,沙門(mén)氏菌主要來(lái)源是患病人和動(dòng)物(牛、豬、羊、家禽等)的腸 道、血液、糞便、尿液，一般情況下腸道帶菌率較高。,防止食品原料和成品被污染控制生長(zhǎng)繁殖食前徹底加熱殺菌,國(guó)標(biāo)法參看食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)(GB/T 4789.4)。熒光抗體技術(shù)、E

11、LISA、單克隆抗體技術(shù)等。商品化的生化快速檢定系統(tǒng)：如API系統(tǒng)、R/B系統(tǒng)、腸管(enterotube)系統(tǒng)等。其中以API系統(tǒng)應(yīng)用較為廣泛，此外還BAX系統(tǒng)在許多國(guó)家用于沙門(mén)氏菌的快速檢測(cè)。,沙門(mén)氏菌屬---檢驗(yàn)方法,API 20E,FDA BAM 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)流程,前增菌 25g樣+225mL乳糖肉湯 （肉制品、肉副產(chǎn)品、動(dòng)物產(chǎn)品）

12、 勻質(zhì)2min，室溫放置60 ±5min 混合均勻，測(cè)定調(diào)節(jié)PH6.8 ±0.2 35℃、

13、24 ± 2h選擇性增菌 0.1ml+10mlMM（RV） 1ml+10mlTTB 42℃、24h （水浴培養(yǎng)）

14、 35℃、24h 43℃、24h（水浴培養(yǎng)） 含菌量高 含菌量低分離培養(yǎng) 劃線接種 選擇性培養(yǎng)基（BS、XLD、HE）

15、 35℃、24~48h（BS）生化鑒定 每個(gè)平板挑取至少2個(gè)可疑菌（包括典型和非典型各2個(gè)） 接種TSI三糖鐵、LIA賴氨酸鐵高層斜面（LIA高層深4cm） （松

16、蓋以保持有氧條件防止產(chǎn)生過(guò)多H2S） 35℃、24±2h 棄去 尿素酶

17、試驗(yàn) 衛(wèi)矛醇、 氰化鉀、丙二酸鈉、吲哚試驗(yàn) 陽(yáng)性 陰性血清學(xué) 血清學(xué)試驗(yàn)——沙門(mén)氏菌的分類

18、 報(bào)告結(jié)果,,,,,,,,,,,,,,生鮮食物、嚴(yán)重污染的食品和動(dòng)物飼料,,,,,ISO6579 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)流程,前增菌 25g樣+225mLBPW 勻質(zhì)

19、 37±1℃、18 ± 2h選擇性增菌 0.1ml+10mlRVS 1ml+10mlMKTTn 41.5 &

20、#177; 1℃、24 ± 3h 37 ± 1℃、24 ± 3h （水浴培養(yǎng)）分離培養(yǎng) 劃線接種選擇性培養(yǎng)基（XLD和第二種選擇性培養(yǎng)基，如 BS）

21、 37℃、24~48h（BS） 每個(gè)平板挑取至少5個(gè)可疑菌進(jìn)行純培養(yǎng)和確認(rèn)試驗(yàn) 37℃、24±3h

22、 生化鑒定 TSI、尿素酶、賴氨酸脫羧酶、β-牛乳糖、V-P、 吲哚試驗(yàn)血清學(xué) 血清學(xué)試驗(yàn)——沙門(mén)氏菌的分類 報(bào)告結(jié)果,,,,,,,,,,,,,,ISO6579 沙門(mén)氏菌生

23、化試驗(yàn)表,沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng),XLD瓊脂：FDA BAM——典型菌落：粉色菌落，帶或不帶黑色中心。許多沙門(mén)氏菌培養(yǎng)物可呈 現(xiàn)大的具光澤的黑色中心或幾乎為全部黑色的菌落。 ——非典型菌落：黃色帶或不帶黑色中心。ISO——中心黑色、周圍由于指示劑顏色的改變而出現(xiàn)紅色的輕微透明帶。,沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)選擇性分

24、離培養(yǎng),BS瓊脂：FDA BAM——典型菌落：產(chǎn)硫化氫菌落黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周 圍的培養(yǎng)基通常開(kāi)始呈褐色，但伴隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而 變?yōu)楹谏?，并有暈環(huán)效應(yīng)； ——非典型菌落：有些菌株不產(chǎn)生硫化氫，形成灰

25、綠色菌落，周圍培養(yǎng) 基不變色。,50071 44104,Blank 50115,沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)選擇性分離培養(yǎng),HE瓊脂：FDA BAM——典型菌落：蘭綠色至蘭色，多數(shù)菌株產(chǎn)硫化氫，菌落帶或不帶黑色 中心或幾乎全黑色。

26、 ——非典型菌落：乳糖陽(yáng)性的菌株為黃色中心黑色或全黑色。,沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)生化鑒定,TSI：典型反應(yīng)：斜面產(chǎn)堿（K）：紅色； 底部產(chǎn)酸（A）：黃色； 產(chǎn)H2S：黑色（少數(shù)不產(chǎn)）,沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)——幾點(diǎn)注意,冷凍樣品解凍需在45℃以下，有自動(dòng)調(diào)溫器自控的水浴鍋內(nèi)不斷攪拌進(jìn)行15min或在2-8℃，18小時(shí)內(nèi)軟化。為保證檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性，必須在選擇性培養(yǎng)基上挑取足夠

27、數(shù)量的菌落進(jìn)行生化和血清學(xué)鑒定。進(jìn)行生化反應(yīng)時(shí)，應(yīng)以純培養(yǎng)物進(jìn)行試驗(yàn)，如出現(xiàn)血清學(xué)陽(yáng)性，而生化反應(yīng)特征不符合時(shí)，應(yīng)對(duì)接種物進(jìn)行純化，用純化后的培養(yǎng)物重新進(jìn)行生化試驗(yàn)。測(cè)試中應(yīng)同時(shí)接種陽(yáng)性對(duì)照菌株。,II 致病性大腸埃希氏菌,大腸桿菌（也稱大腸埃希氏菌），分類于腸桿菌科，歸屬于埃希氏菌屬。大腸桿菌指革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣、IMViC試驗(yàn)（靛基質(zhì)、MR、V-P、檸檬酸鹽試驗(yàn)）為++--或-+--的細(xì)菌。與人類有關(guān)的

28、大腸桿菌統(tǒng)稱為致瀉性大腸桿菌，包括五種：腸毒素性大腸桿菌（ETEC）、致病性大腸桿菌（EPEC）、出血性大腸桿菌（EHEC）、侵襲性大腸桿菌（EIEC）、黏附性大腸桿菌（EAEC）。,大腸菌群和大腸桿菌的關(guān)系,耐熱大腸菌群的定義：能在液體乳糖培養(yǎng)基中35/37 ℃ 培養(yǎng)48h產(chǎn)酸產(chǎn)氣，并在44.5℃培養(yǎng)24h產(chǎn)酸產(chǎn)氣的細(xì)菌（依據(jù)ISO標(biāo)準(zhǔn)）,衛(wèi)生學(xué)意義,大腸菌群和大腸桿菌是評(píng)價(jià)衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，作為食品中的糞便污染指標(biāo)。食品中檢出大

29、腸菌群，表明該食品有糞便污染，既可能有腸道致病菌存在，因而也就有可能通過(guò)污染的食品引起腸道傳染病的流行。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對(duì)人體健康危害性的大小。大腸桿菌在外界存活時(shí)間與一些主要腸道致病菌接近，它的出現(xiàn)預(yù)示著某些腸道病原菌的存在，因此該菌是國(guó)際上公認(rèn)的衛(wèi)生監(jiān)測(cè)指示菌。近年來(lái)，有些國(guó)家在執(zhí)行HACCP管理中，將大腸桿菌檢測(cè)作為微生物污染狀況的監(jiān)測(cè)指標(biāo)和HACCP實(shí)施效果的評(píng)估指標(biāo)。,大腸桿菌的生物學(xué)特性,基

30、本形態(tài)： 此菌為兩端鈍圓的短小桿菌，一般約0.5-0.8μm*1.0-3.0 μm，多單獨(dú)存在或成雙，但不呈長(zhǎng)鏈排列。約50%的菌株有周生鞭毛，但多數(shù)只有1-4根，一般不超過(guò)10根，故菌體動(dòng)力弱。多數(shù)菌株有菌毛，有的有莢膜或微莢膜，不形成芽孢，對(duì)普通堿性染料著色良好，革蘭氏染色陰性。,大腸桿菌的生物學(xué)特性,培養(yǎng)特性：大腸桿菌合成代謝能力強(qiáng)，在含無(wú)機(jī)鹽、銨鹽、葡萄糖的普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好。最適生長(zhǎng)溫度為37℃，在42-44 ℃條

31、件下仍能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)溫度范圍15-46 ℃。,在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂上有3中菌落形態(tài)： 1）光滑型：菌落邊緣整齊，表面有光澤、濕潤(rùn)、 光滑、呈灰色，在生理鹽水中易分散； 2）粗糙型：菌落扁平、干澀、邊緣不整齊，易 在生理鹽水中自凝； 3）黏液型：常為含有莢膜的菌株。,大腸埃希氏菌的抗原,菌體抗原（O抗原）鞭毛抗原（H抗原）表面抗原（K抗原）：莢膜抗原、被膜抗原、表面抗原,該菌屬的抵抗力,本菌在自然界生存力較強(qiáng)。在

32、土壤、水中可存活數(shù)月，在寒冷干燥的環(huán)境中可存活較久，而在潮濕、溫暖的環(huán)境中，存活不到1個(gè)月。對(duì)熱抵抗力不強(qiáng)，60℃加熱30min即可被殺死。本菌培養(yǎng)物在室溫中可存活數(shù)周，如密封者在黑暗室溫(20～22℃)中至少能保存1年，凍干菌種置低溫(-20℃以下)至少能活10年。對(duì)常用消毒劑抵抗力不強(qiáng)，5％～10％漂白粉、3％來(lái)蘇兒、5％石炭酸等均能迅速殺死大腸桿菌。對(duì)氯很敏感，在含有0.2mg/kg游離氯的水中，即可很快死亡。對(duì)強(qiáng)酸和強(qiáng)堿較敏

33、感。,致病因素,多數(shù)大腸埃希菌在腸道內(nèi)不致病，但如移位至腸道外的組織或器官，如尿道、膽道、前列腺、肺、骨和腹腔等其他部位則可引起腸道外感染。腸道外感染以泌尿系統(tǒng)和化膿性感染最為常見(jiàn)。,致病性E.coli引起食物中毒一般與人體攝人的活菌量有關(guān)。只有食品中活菌數(shù)在107cfu/g以上，才可使人致病。其中毒原因同沙門(mén)氏菌。,中毒的原因,中毒的機(jī)理,當(dāng)致病性E.coli進(jìn)人人體消化道后，ETEC可在小腸內(nèi)繼續(xù)繁殖，產(chǎn)生腸毒素。腸毒素吸附于小

34、腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上EIEC可以侵入結(jié)腸黏膜的上皮細(xì)胞。,中毒的癥狀,EAEC、EPEC、ETEC、EHEC、EIEC,引起中毒的食品：主要是肉類、乳與乳制品、水產(chǎn)品、豆制品、蔬菜，尤其是肉類和涼拌菜。 污染途徑：致病性E.coli主要寄居于人和動(dòng)物腸道中，隨糞便污染。預(yù)防中毒措施： 1.防止食品原料和成品被帶菌的人和動(dòng)物，以及污水、不潔的容器和用具等污染； 2.低溫冷藏生肉、熟食品和其他動(dòng)物性食品，一般應(yīng)置于4～5℃低溫

35、儲(chǔ)藏； 3.食前徹底加熱殺菌。,致病性大腸埃希氏菌--檢驗(yàn)方法,國(guó)標(biāo)法參看食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)(GB/T 4789.6)。檢測(cè)大腸桿菌及其腸毒素的新技術(shù)、新方法很多。如用K88單抗血清對(duì)糞中K88菌檢出率比常規(guī)培養(yǎng)法提高1倍，最小檢測(cè)菌量為10 000cfu/mL。987P酶標(biāo)單抗對(duì)糞便和腸內(nèi)容物最小檢出菌量為2 000cfu/mL。對(duì)致病性大腸桿菌毒力基因檢測(cè)，過(guò)去多用動(dòng)物或細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定，現(xiàn)可用其單抗以多種

36、免疫學(xué)手段檢出。如用免疫磁分離法檢測(cè)牛糞便和食品標(biāo)本的大腸桿菌O157：H7，可提高了大腸桿菌O157：H7感染病例的檢出率。 據(jù)報(bào)道，2004年10月，美國(guó)佛羅里達(dá)大學(xué)科學(xué)家使用納米粒子技術(shù)，開(kāi)發(fā)出一種新的大腸桿菌檢測(cè)法，即使樣本里只有一個(gè)大腸桿菌也能檢測(cè)出來(lái)，整個(gè)過(guò)程只需要20min。,大腸菌群測(cè)定 — MPN法檢驗(yàn)流程（FDA BAM）,檢樣50g+450ml稀釋液

37、 適當(dāng)十倍稀釋樣品選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品稀釋液，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯（每管9mlLST肉湯并加有導(dǎo)管），每管接種1mL 35℃ ，24 ± 2h ~48 ± 2h 沒(méi)有產(chǎn)氣管

38、 有產(chǎn)氣管 報(bào)告陰性 接種BGLB肉湯管 接種EC肉湯 35 ± ℃ ，48 ±

39、 2h 44.5±0.5 ℃ （水浴培養(yǎng)） 24 

40、7; 2h ~48 ± 2h 查MPN表報(bào)告結(jié)果 產(chǎn)氣管接種EMB平板（35℃、18~24h） （大腸菌群） 從EMB平板上挑取5個(gè)可疑菌轉(zhuǎn)接到PCA斜

41、 面，進(jìn)行革蘭氏染色、IMVC生化鑒定、接 種LST復(fù)檢產(chǎn)氣

42、 查MPN表報(bào)告結(jié)果（大腸桿菌）,,,,,,,,,,,,,,大腸菌群測(cè)定——MPN法檢驗(yàn)幾點(diǎn)說(shuō)明,MPN檢索表： MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡(jiǎn)稱。這種方法，對(duì)樣品進(jìn)行連續(xù)系列稀釋，加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應(yīng)呈陽(yáng)性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來(lái)推算樣品中菌數(shù)最近似的

43、數(shù)值。MPN檢索表只給了三個(gè)稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低或增加10倍。初發(fā)酵和證實(shí)試驗(yàn)： 1）兩步法進(jìn)行了兩次乳糖發(fā)酵試驗(yàn)。初發(fā)酵和證實(shí)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基不同，但都是為了證實(shí)培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣”。 LST中提供了磷酸鹽緩沖體系，氯化鈉可維持滲透壓，月桂基硫酸鈉可抑制非大腸菌群的生長(zhǎng)，這個(gè)緩沖蛋白胨乳糖肉湯允許“緩慢乳糖發(fā)酵（Slow lactose fermentatio

44、ns）”來(lái)促進(jìn)菌體產(chǎn)氣。BGLB中膽鹽和煌綠可以抑制革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和除了大腸菌群的很多革蘭氏陰性細(xì)菌。 2）初發(fā)酵陽(yáng)性管，不能肯定就是大腸菌群細(xì)菌，經(jīng)過(guò)證實(shí)試驗(yàn)后，有時(shí)可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗(yàn)步驟的符合率，初發(fā)酵與證實(shí)試驗(yàn)相差較大。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，證實(shí)試驗(yàn)是必需的。產(chǎn)氣量與倒管： 在乳糖發(fā)酵試驗(yàn)工作中，經(jīng)常可以看到在發(fā)酵倒管內(nèi)極微少的氣泡（有時(shí)比小米粒還?。?，有時(shí)可以遇到在初發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管

45、壁有緩緩上浮的小氣泡。實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問(wèn)時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。,大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別,EMB平板典型大腸桿菌菌落特征：中心黑色或紫紅色，有或無(wú)綠色金屬光澤,大腸桿菌測(cè)定——EMB選擇性分離鑒別,EMB是一種弱選擇性培養(yǎng)基，一些球菌也可在該培養(yǎng)

46、基上生長(zhǎng)；高壓滅菌可使得美藍(lán)還原從而使培養(yǎng)基的顏色呈不均一橘黃色，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)基可以恢復(fù)原有的正常紫色，傾注平板前應(yīng)先搖勻；大腸桿菌在該培養(yǎng)基上并不一定總是呈現(xiàn)綠色的金屬光澤；該培養(yǎng)基受可見(jiàn)光易使其中的成分氧化，儲(chǔ)存及培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)都應(yīng)在避光條件。,大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色,基本原理： 革蘭氏染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種重要的鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。此法可將細(xì)菌分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)

47、性菌兩大類。 革蘭氏染色的機(jī)理主要是利用兩類細(xì)菌的細(xì)胞壁成分和結(jié)構(gòu)的不同。革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁中含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少。當(dāng)用酒精或丙酮酸脫色時(shí)，類脂質(zhì)被溶解，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染后的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染液的顏色。而革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁中肽聚糖的含量多而且交聯(lián)度大，類脂質(zhì)含量少，經(jīng)乙醇或丙酮洗脫后，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏

48、色。,大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色,Gram negative,Gram positive,Gram straining,大腸桿菌測(cè)定——革蘭氏染色,基本步驟：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染液，染1min，水洗；滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗；滴加95%乙醇脫色約15～30s,直至染色液被洗掉，不要過(guò)分脫色，水洗；滴加番紅復(fù)染液，復(fù)染1min，水洗、待干、鏡檢。結(jié)果：革蘭氏陽(yáng)性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。,,,大腸桿菌測(cè)

49、定——生化鑒定,IMViC試驗(yàn)：細(xì)菌的生化反應(yīng)用于鑒別細(xì)菌，尤其對(duì)形態(tài)、革蘭染色反應(yīng)和培養(yǎng)特性相同或相似的細(xì)菌更為重要。 吲哚（I）、甲基紅（M）、VP（V）、枸櫞酸鹽利用（C）四種試驗(yàn)常用于鑒定腸道桿菌，合稱為IMViC試驗(yàn)。,某些細(xì)菌有色氨酸酶，能分解色氨酸形成吲哚； 將對(duì)二甲基氨基苯甲醛加入細(xì)菌蛋白胨水培養(yǎng)液中，吲哚 與試劑中的對(duì)二甲基氨基苯甲醛結(jié)合，呈紅色反應(yīng)，形成 玫瑰吲哚，為吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性。不出現(xiàn)紅色則為陰性。,

50、吲哚試驗(yàn)：,,產(chǎn)氣腸桿菌使丙酮酸脫羧后形成中性產(chǎn)物， 培養(yǎng)液PH>5.4，甲基紅指示劑呈橘黃色，為甲基紅試驗(yàn)陰性，大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，培養(yǎng)液呈酸性 PH<5.4，指示劑甲基紅呈紅色，稱甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性。,甲基紅試驗(yàn)：,大腸埃希菌與產(chǎn)氣腸桿菌分解葡萄糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，為區(qū)分兩菌可采用V-P試驗(yàn)及甲基紅試驗(yàn)。產(chǎn)氣腸桿菌能使丙酮酸脫羧，氧化（在堿性溶液中）生成二乙酰，后者可與含胍基的化合物反應(yīng)，生成紅色化合物

51、，稱V-P試驗(yàn)陽(yáng)性；大腸埃希菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，V-P試驗(yàn)陰性。,V-P試驗(yàn)：,,能利用枸櫞酸鹽作為唯一碳源的細(xì)菌 如產(chǎn)氣腸桿菌，分解枸櫞酸鹽生成碳酸鹽，同時(shí)分解培養(yǎng)基的銨鹽生成氨，使培養(yǎng)基呈堿性，使指示劑溴麝香草酚藍(lán)（BTB）由淡綠轉(zhuǎn)為深藍(lán)，此為枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陽(yáng)性。,枸櫞酸鹽利用試驗(yàn):,I M Vi C生化試驗(yàn),III 副溶血性弧菌,副溶血性弧菌（ Vibrio parahaemolyticus ）是分布極廣的海洋細(xì)菌，為引

52、起食物中毒重要的病原細(xì)菌之一，尤其是在夏秋季節(jié)的沿海地區(qū)，經(jīng)常發(fā)生由于食用帶有大量副溶血性弧菌的海產(chǎn)食品，引起爆發(fā)性食物中毒。 歷史：副溶血性弧菌食物中毒于1950年在日本首發(fā)，副溶血性弧菌（V. parahemolyticus）于我國(guó)大陸沿海地區(qū)食物中毒中最常見(jiàn)的一種病原菌。,菌體形態(tài)學(xué)特征 本菌為G-彎曲的球桿菌，或呈弧菌，可兩端濃染 ，多形態(tài)，無(wú)芽孢，單端單鞭毛，有嗜鹽特性，在30-37℃最適溫度時(shí)增長(zhǎng)較快

53、，一般冬季不易檢出。,多形態(tài)： 弧狀、逗點(diǎn)狀 球狀、絲狀、 桿狀、棒狀等。,54,培養(yǎng)特性 嗜鹽：VP 在含氯化鈉5 –(20-30－最適) g/L的培養(yǎng)基 上生長(zhǎng)，無(wú)鹽和110g/L以上不生長(zhǎng)。 生長(zhǎng)溫度：最適為37℃，4 ℃不生長(zhǎng) pH: 最適pH為7.4-8.0 需氧性: 需氧性很強(qiáng)， 厭氧條件下生長(zhǎng)緩慢,55,培養(yǎng)特性在液體培養(yǎng)基中

54、，呈現(xiàn)渾濁，表面形成菌膜，R型菌發(fā)生沉淀。在固體培養(yǎng)基上的菌落通常為隆起，圓形，稍渾濁，不透明，表面光滑濕潤(rùn)，傳代之后常出現(xiàn)不圓整、粗糙型菌落，或灰白色半透明或不透明的菌落。 S.S平板：菌落中等大小，1-2mm圓形，扁平，無(wú)色透明的黏性菌落，不易被接種環(huán)挑起。氯化鈉蔗糖瓊脂：菌落l-2mm，稍隆起，渾濁、無(wú)黏性、濕潤(rùn)、中心綠色的菌落，具有擴(kuò)散性菌落是本菌的一個(gè)生長(zhǎng)特點(diǎn)。伊紅美蘭瓊脂：某些菌株在麥康凱上生長(zhǎng)，生長(zhǎng)的菌落呈圓形，平

55、坦、半透明或渾濁，略帶紅色。3.5％食鹽瓊脂平板：37℃24h培養(yǎng)多呈蔓延狀生長(zhǎng)，菌落的邊緣不整齊，圓形，隆起，稍渾濁、不透明、表面光滑濕潤(rùn)。如培養(yǎng)基中含有膽酸鹽則能對(duì)細(xì)菌的蔓延有一定的抑制作用。細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中形成色素。,生化特性,副溶血性弧菌能分解發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、淀粉和阿拉伯膠糖，產(chǎn)酸，不產(chǎn)氣。不能發(fā)酵乳糖、蔗糖、纖維二糖、木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、水楊苷。產(chǎn)生靛基質(zhì)，液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽。過(guò)氧化氫酶和卵磷

56、脂酶為陽(yáng)性，尿素酶為陰性，V-P試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)生硫化氫，能分解淀粉和酪蛋白，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性，對(duì)弧菌抑制劑三氨基二異丙基喋啶敏感。,57,抵抗力 敏感：淡水等無(wú)鹽環(huán)境 不耐熱 對(duì)酸敏感，在2％冰醋酸或食醋中立即死亡， 對(duì)氯、碳酸、來(lái)蘇水等一般化學(xué)消毒劑敏感： 對(duì)磺胺噻唑、氯霉素、合霉素敏感。 耐受：耐高濃度N

57、aCl－海水，鹽漬醬菜中存活時(shí)間較長(zhǎng)； 耐低溫的抵抗力較強(qiáng) 耐青霉素、磺胺嘧啶。,中毒原因: 食入了含有106cfu/g 以上的致病性活菌 和一定量溶血毒素的食品。烹調(diào)時(shí)未 燒熟、煮、透,或熟制品污染后未再?gòu)?底加熱。 中毒食品: 副溶血性弧菌食物中毒多發(fā)生在海產(chǎn) 品大量上市時(shí)。中毒食品

58、主要是海產(chǎn)品, 其次為咸菜、熟肉類、禽肉、禽蛋類, 約有半數(shù)為腌制品。,,中毒的機(jī)理：活菌進(jìn)入腸道侵入黏膜引起腸黏膜的炎癥反應(yīng)，同時(shí)產(chǎn)生Vp-TDH，作用于小腸壁的上皮細(xì)胞，導(dǎo)致消化道癥狀，毒素進(jìn)一步由腸黏膜受損部位侵入體內(nèi)，與心肌細(xì)胞表面受體結(jié)合。該菌食物中毒是致病菌對(duì)腸道的侵入和溶血毒素協(xié)同作用所致，是一種混合型食物中毒。中毒癥狀：潛伏期一般11-18h。表現(xiàn)為急性胃腸炎癥狀。主要病

59、變?cè)谑改c、空腸和回腸上部。一般病后3-5d痊愈，死亡率很低。少數(shù)重癥者出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉脫水而虛脫，呼吸困難、血壓下降而休克，如搶救不及時(shí)可死亡。,污染途徑 海水、海產(chǎn)品、海鹽、帶菌者是污染源。預(yù)防中毒措施 防止食品被污染 最好不食用生或半熟的海產(chǎn)品 食前徹底加熱殺菌 控制細(xì)菌繁殖,61,檢驗(yàn)程序：副溶血性弧菌的檢驗(yàn)多采用國(guó)標(biāo)法(GB/T 4789.7),25g樣品+3%氯化鈉堿性蛋白胨水,TCBS平板,3

60、6± 1℃ 18h,1、鏡 檢 3、三糖鐵試驗(yàn)2、氧化酶試驗(yàn) 4、嗜鹽試驗(yàn),,報(bào)告結(jié)果,,定性檢測(cè),36± 1℃ 24h,36± 1℃ 24h,36± 1℃ 6h,,,科瑪嘉弧菌平板,,,,,,,,,生化實(shí)驗(yàn) API 20 E,62,培養(yǎng)基和試劑3%氯化鈉堿性蛋白胨水： 增菌用，高鹽 TCBS瓊脂：

61、 科瑪嘉瓊脂：,分離培養(yǎng)用,,63,范圍,本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了副溶血性弧菌檢驗(yàn)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于動(dòng)物性水產(chǎn)干制品、腌醉制生食動(dòng)物性水 產(chǎn)品、即食藻類食品、魚(yú)糜制品等水產(chǎn)食品和水產(chǎn)調(diào)味 品以及食物中毒樣品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)。,,64,,TCBS上的副溶血弧菌菌,,科瑪嘉上的副溶血弧菌菌落,65,初步鑒定 3.5％氯化鈉三糖鐵瓊脂：底層 變黃，斜面不變色，有動(dòng)力， 不產(chǎn)生硫化氫.鏡檢形態(tài)：

62、本菌為G-，可兩端 濃染 ，多形態(tài)，無(wú)芽孢。氧化酶試驗(yàn)：VP為氧化酶陽(yáng)性。嗜鹽性試驗(yàn)：0%不生長(zhǎng) 7%旺盛生長(zhǎng) 10%不生長(zhǎng),66,ONPG試驗(yàn)：甘露醇試驗(yàn)：賴氨酸試驗(yàn)：MR-VP試驗(yàn)：,生化試驗(yàn),,67,結(jié)果 樣品經(jīng)過(guò)增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)后，根據(jù)形態(tài)觀察、生化試驗(yàn)的結(jié)果判斷是否發(fā)現(xiàn)副溶血性弧

63、菌并報(bào)告。,,IV 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌,小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)是國(guó)際上引起重視的人、畜共患病原菌之一，也是一種非常重要的新的食源性病原菌。本菌在0～4℃仍能繼續(xù)繁殖，并產(chǎn)生毒素，如在4℃下能存活18個(gè)月。因此，冰箱內(nèi)存放的污染食品對(duì)人仍具有感染性。耶爾森氏菌屬包括11個(gè)種，其中對(duì)人有致病性的有三種：小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、假結(jié)核菌和鼠疫菌。只有小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和假結(jié)核菌已確定是食源

64、性病原體.一般說(shuō)小腸結(jié)腸炎耶氏菌即是指典型小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。,短小、卵圓形或桿狀的革蘭氏陰性桿菌在陳舊培養(yǎng)物呈多形性，普通堿性染料易著色，美藍(lán)染色可顯示兩極濃染。,形態(tài)及染色特性,本菌為需氧和兼性厭氧菌，最適生長(zhǎng)溫度25～30℃。最適生長(zhǎng)pH為7.2～7.4。在普通培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，對(duì)膽鹽、煌綠、結(jié)晶紫、孔雀綠及氯化鈉均有一定耐受性。普通瓊脂：菌落呈圓形，光滑，稍隆起，透明或半透明普通肉湯：呈均勻渾濁，偶有薄膜或少量沉淀物

65、麥康凱瓊脂：菌落呈圓形，光滑，透明或半透明，略扁平，淡粉色，S.S瓊脂：菌落呈圓形，光滑，稍突起，略呈淺橘紅色，或淡粉色,生長(zhǎng)要求與培養(yǎng)特性,生化特性不穩(wěn)定，培養(yǎng)在25℃和37℃的反應(yīng)結(jié)果有差異，能發(fā)酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、山梨醇。尿素酶陽(yáng)性，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，β-半乳糖苷酶陽(yáng)性、MR試驗(yàn)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)(22℃)陽(yáng)性，V-P試驗(yàn)(37℃)陰性，不分解乳糖、鼠李糖。苯丙氨酸脫氫酶、細(xì)胞色素氧化酶、H2S陰性，不利用檸檬酸鹽。,生化特性

66、,本菌對(duì)熱敏感，60℃30min，65℃1min即可殺死。牛乳中的耶氏菌通過(guò)巴氏滅菌不能完全被殺死。對(duì)低溫有較強(qiáng)的耐受性，在4℃下可活存18個(gè)月，在-20～-18℃冷藏肉的保藏過(guò)程中，菌數(shù)明顯減少。本菌對(duì)抗生素的敏感性不定，但對(duì)青霉素、紅霉素、先鋒霉素、氨芐青霉素不敏感。 輻射對(duì)本菌有一定的殺滅作用。,抵抗力,該菌可寄生于所有恒溫動(dòng)物，引起出血性敗血癥；該菌有侵犯中胚層性細(xì)胞的傾向，一般表現(xiàn)為淋巴腺鼠疫和肺鼠疫的發(fā)生。腸毒素：該

67、菌能產(chǎn)生耐熱性腸毒素，但腸毒素的產(chǎn)生僅限于22～25℃；侵襲性：Hela細(xì)胞感染陽(yáng)性株多是人類致病常見(jiàn)血清型；自凝性：菌接種于10％小牛血清的組織培養(yǎng)液內(nèi)，22℃培養(yǎng)，菌液渾濁，而37℃培養(yǎng)，細(xì)菌凝結(jié)，上層液體透明，即為有毒力的菌株，稱為自凝陽(yáng)性。VW抗原：在25℃生長(zhǎng)時(shí)不需要鈣的菌株即含VW抗原。毒性質(zhì)粒：耶氏菌病和小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌帶有41～48Mu的質(zhì)粒有關(guān)。,致病因素,主要原因是食入了具有侵襲力的活菌及其腸毒素食品，尤

68、其是冷藏食品食用前未徹底加熱殺菌，引起中毒。潛伏期3～5d主要癥狀是胃腸炎，以小腸、結(jié)腸炎為多見(jiàn)，腹痛，腹瀉多為黏液或水樣便，頭痛，體溫38～39.5℃。此外，引起腹膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、腸系膜淋巴結(jié)炎和敗血癥等。,中毒的原因與癥狀,主要通過(guò)污染食物(豬肉、牛肉、牛奶等)和水源引起感染。主要存在于乳與乳制品、蛋制品、肉與肉制品、豆腐及其制品、海產(chǎn)品和蔬菜等。據(jù)檢測(cè)，豬比其他動(dòng)物，如牛、羊、雞、鴨、鵝等帶菌率高，豬是此菌的主