共聚焦顯微鏡-北京大學單分子與納米生物學實驗室

1、激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)技術(shù)簡介,He XiaohuiSu Meng 90513103Li Wei 90513104,Introduction LSCM 是一種高科技顯微鏡熒光顯微鏡成像為基礎(chǔ)，加裝了激光掃描裝置, 計算機進行圖像處理, 使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針, 得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像。無損傷的“光學切片”細胞三維立體機構(gòu)實時動態(tài)分析監(jiān)測,光學顯微鏡部分激光發(fā)射器掃描裝置

2、光檢測器計算機系統(tǒng)( 包括數(shù)據(jù)采集, 處理, 轉(zhuǎn)換, 應用軟件) 圖像輸出設(shè)備,LSCM的基本組成,LSCM的原理,LSCM對生物樣品的觀察的優(yōu)越性：連續(xù)掃描 三維離子熒光標記同時多重物質(zhì)標記,LSCM的發(fā)展,,濾片式LSCM 棱鏡狹縫分光式LSCM,LSCM在醫(yī)學及生物學研究中的應用,LSCM常用于生物細胞或組織內(nèi)的分子原

3、位鑒定和定量,細胞及亞細胞結(jié)構(gòu)形態(tài)學觀察; 以及活體細胞或組織功能的動態(tài)監(jiān)測. 在生命科學領(lǐng)域的分子水平,細胞及組織水平的研究中得到廣泛應用.,一 原位鑒定細胞或組織內(nèi)生物大分子,觀察細胞及亞細胞形態(tài)結(jié)構(gòu),在細胞原位用特異探針標記出核酸,蛋白質(zhì),多肽,酶,激素,磷脂,多糖,受體等分子并用激光掃描共聚焦顯微鏡成像,從而實現(xiàn)上述大分子的定位,定性及定量檢測,,(一)在細胞原位檢測核酸(二) 原位檢測蛋白質(zhì),抗體及其他分

4、子(三)檢測細胞凋亡(四)細胞器觀察及測定(五)檢測細胞融合(六)觀察細胞骨架(七)檢測細胞間縫隙連接通訊(八)檢測細胞內(nèi)脂肪,(一)在細胞原位檢測核酸,檢測核酸的熒光探針1 碘化丙啶 (PI)---不能進入完整的細胞膜2 Hoechst33342,Hoechst33258 和DAPI3 AO(吖啶橙),(二) 原位檢測蛋白質(zhì),抗體及其他分子,常用的熒光探針:1 熒光染料FITC: 藍光激發(fā),發(fā)出明亮綠色熒光

5、2 羅丹明: 比FITC光穩(wěn)定性好,在生理條件下對PH變化不敏感,熒光強度受細胞自發(fā)熒光的干擾較小,3 綠色熒光蛋白（ green fluorescent protein GFP）,,,,*可對活細胞中的蛋白質(zhì)進行準確定位及動態(tài)觀察,(三)檢測細胞凋亡,通常用的方法:1 細胞核形態(tài)觀察2 脫氧核苷酸未端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)3 Annexin-V試劑盒是檢測凋亡細胞膜損傷的新方法,,(四)細胞器觀察及測定,不

6、同實驗目的,標記細胞器的方法也不同.,1線粒體 Mitochondria Rodamin 123 Mitotracker Green FM Mitotracker Orange CMTMRos Mitotracker Orange 2 溶酶體 Lysosome 中性紅 AO LysoTracker G

7、reen DND-26 / Blue/ Red3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC64 高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie,(五)檢測細胞融合,根據(jù)不同細胞的特性,將每一種細胞特有的物質(zhì)用不同的熒光控針標記;融合操作后,確認不同的熒光信號是否發(fā)生共定位于同一細胞;如在同一細胞中同時檢測 到上述不同的熒光信號,則說明已經(jīng)發(fā)生了細胞融合

8、.,(六)觀察細胞骨架,骨架(微絲,微管和中等纖維)直標: 一抗+熒光探針(如:肌動蛋白actin )間標: 二抗+熒光探針(如:微管蛋白tublin),,,肌動蛋白(Actin)標記肌動蛋白是微絲的基本成分 毒傘素(鬼筆環(huán)肽)---與多聚體肌動蛋白微絲專一性結(jié)合起來且親和作用強烈.,,,

9、微管蛋白(Tubulin)標記,(七)檢測細胞間縫隙連接通訊,染料熒光黃(LY)---黃色帶電荷的小分子強熒光物質(zhì),不通過細胞膜,但可以很容易通過GJIC,從標記的細胞(劃痕法)傳輸?shù)洁徑毎?觀察LY向鄰近細胞的傳輸速率,用以表示GJIC連接通訊功能,,漂白細胞(箭頭標記)熒光漂白前(A)及漂白后0(B)、2(C)和4(D)min時的熒光恢復情況經(jīng)瞬間漂白后細胞內(nèi)熒光強度明顯變?nèi)酰S著時問的推移．熒光逐漸恢復，至4

10、 min時(D)．可見熒光強度明顯恢復．,FRAP法測定膀胱平滑肌細胞GJIC功能,(八)檢測細胞內(nèi)脂肪,尼羅紅(Nile red):是一個理想的脂肪染色劑,它只在疏水環(huán)境中顯示很強的熒光.除了在所需顯示的脂質(zhì)中被溶解外,尼羅紅與組織不發(fā)生任何反應.,二 活體細胞或組織功能的實時動態(tài)監(jiān)測,利用相應的特異熒光控針標記后觀察單個細胞不同部位或不同組織區(qū)域接受刺激后的整個變化過程,,(一)實時定量測定細胞內(nèi)Ca2+的變化(二)測定細胞內(nèi)

11、PH變化(三) 檢測膜電位的變化(四)檢測細胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生(五)檢測藥物等跨膜進入組織或細胞過程及其定位(六)檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)(七)檢測熒光漂白恢復(FRAP),Fluo-3較為常用,基本原理:a其乙酰羥甲基酯(AM)形式是Fluo-3AM,無熒光,為不帶電荷的親脂性化合物,易于滲透脂膜進入活細胞內(nèi) b在胞內(nèi)被非特異酯酶水解,釋放出游離酸形式的熒光探針分子,此游離態(tài)也無熒光,不易漏出胞外c一旦

12、與Ca2+結(jié)合后便形成復合物,并有較強的熒光產(chǎn)生,從而發(fā)揮其鈣探針的作用.,KCL誘導的細胞外Ca++內(nèi)流測量,培養(yǎng)/分離的細胞 ? 20?M Fluo 3-AM負載液30-60min ? 清洗、換液 ? 掃描,,,(二)測定細胞內(nèi)PH變化,常用的熒光探針有BCECF和6-COFDABCECF的激發(fā)光譜是PH依賴性的比例法:即分別用490nm和440nm光激發(fā)BCECF所得到的發(fā)射熒光之比(比例熒光與PH有很好的線性關(guān)系)最

13、大分辯率為0.4PH單位.,(三) 檢測膜電位的變化,快響應探針: 膜電位直接影響探針分子的電分布而改變其光譜,響應快慢響應探針: 主要通過改變其在膜內(nèi)外的分布來對膜電位的變化作出反應.跨膜運動需要一定的時間,所以反應慢.,,依探針對電位變化響應速度,將電位敏感探針分為快響應探針和慢響應探針,(四)檢測細胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生,基本原理:a DCFH-DA進入細胞后b 經(jīng)酯酶作用脫去二酯,生成不發(fā)熒光的DCFHc 被超氧陰離子,

14、過氧化氫等活性氧化生成發(fā)熒光的DCF d 活性氧自由基的含量與熒光探針之熒光強度成正相關(guān),DCFH-DA常用于直接測定細胞內(nèi)活性氧自由基的動態(tài)變化,(五)檢測藥物等跨膜進入組織/細胞過程及定位,為檢測藥物分子,病毒,細菌等外界物質(zhì)能否跨膜進入細胞/組織,需利用這些物質(zhì)特異性自發(fā)熒光/對其進行熒光標記.,(六)檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET),由于熒光蛋白的獨特優(yōu)點,其特定的熒光對理論上可用于活細胞中實時研究大分子間的相互作用.,熒光能

15、量共振轉(zhuǎn)移 (Fluorescence Resonance Energy Transfer),I.熒光能量共振轉(zhuǎn)移: 受激態(tài)熒光素將其能量向另一個熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體熒光素。,,供體熒光素 受體熒光素,1.供體與受體間的距離 <10nm或=1-7nm2.供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有實質(zhì)性的重疊,II.熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條

16、件,,,,,488nm 520nm 650nm,供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素 (Cy3),,供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素 (Cy3),(七)檢測熒光漂白恢復(FRAP),FRAP:是將待測細胞用熒光物質(zhì)標記,借助高強度脈沖式激光照射細胞的某一區(qū)域,從而造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅;通過低強度

17、激光掃描成像,可以探測到該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子向受照射區(qū)域擴散的速率.從理論上講,凡是能夠標記待測分子,并且能夠發(fā)生熒光淬滅的熒光物質(zhì)都可以使用.,1. 熒光漂白恢復 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 檢測細胞連接間的信息傳遞,,,激光掃描共焦顯微鏡的發(fā)展趨勢,多光子激光掃描顯微鏡— Multiphoton Laser Scanning M

18、icroscopy在生物及醫(yī)學成像,單分子探測,三維信息存儲,微加工等領(lǐng)域得到廣泛應用,展示了廣闊的發(fā)展前景.,多光子激光掃描顯微鏡簡介,多光子激光器波長從700-1000nm連續(xù)可調(diào) 雙光子波長：350-500nm 連續(xù) 三光子波長：230-330nm 連續(xù)應用：可直接清晰活體觀察某些非標記神經(jīng)遞質(zhì)的分泌 (5-HT) 或 NADPH的分布,雙光子激光掃描熒光顯微系統(tǒng),照射光波長大于熒光染料吸收峰波長2倍 高

19、能量(2KW)、超短脈沖(兆分之一秒)聚焦, 使聚焦點瞬間產(chǎn)生高密度光子, 出現(xiàn)雙光子吸收激發(fā)熒光 雙光子吸收僅發(fā)生在聚焦點, 避免了焦點外激發(fā)而產(chǎn)生的漂白現(xiàn)象高能量、超短脈沖聚焦、穿透性更強 50 ?m 500 ?m,,,,488nm 520nm,,FITC,,,,976nm,,,多光子激光掃描顯微鏡優(yōu)點與局限:,優(yōu)點:1 對生物樣品的光損傷小2 有效觀測時間長3 穿透深