培養(yǎng)細胞的基本特征

1、組織培養(yǎng)教學參考書,組織培養(yǎng)和分子細胞學技術(shù)，鄂征，北京出版社體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)，薛慶善，科學出版社,細胞培養(yǎng)是動物細胞工程的基礎(chǔ),Introduction to Cell andTissue CultureTheory and Technique,Section 1：培養(yǎng)細胞的生物學特征,◆ 動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念◆ 動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史◆ 動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,一、動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念,通稱的動物

2、組織培養(yǎng)(ATC - Animal tissue culture),（1）究竟在培養(yǎng)什么?,體外培養(yǎng)（In Vitro）組織培養(yǎng)（Tissue Culture）細胞培養(yǎng)（Cell Culture ）器官培養(yǎng)（Organ Culture ）,分類:◆ 組織培養(yǎng)(Tissue Culture) 指的是從體內(nèi)取出組織，在模擬體內(nèi)生理環(huán)境，無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下，使之生存和生長并維持其結(jié)構(gòu)和功能的方法◆ 細胞培養(yǎng)(Cell

3、 Culture) 培養(yǎng)物是單個細胞和細胞群◆ 器官培養(yǎng)（Organ Culture） 培養(yǎng)的是器官的原基、器官的一部分或整個器官，使之在體外生存、生長和保持一定功能的方法,◆ 體外培養(yǎng)細胞的目的是什么？應用價值,◆ 體外培養(yǎng)細胞與體內(nèi)細胞有否差異？,研究體內(nèi)相應器官、組織和細胞的正常和異常生命活動,增殖方式相同：有絲分裂差異的關(guān)鍵：細胞的分化,◆ 人工模擬條件與體內(nèi)環(huán)境的差異？,失去了神經(jīng)體液調(diào)節(jié)和細胞間相互作用，缺乏動態(tài)平衡,（

4、2）傳代與原代培養(yǎng)？,◆ 傳代：（subculture） 體外培養(yǎng)細胞生存空間和營養(yǎng)有限，當細胞增殖達到一定密度后，需要分出一部分細胞或更新培養(yǎng)液，否則將影響細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代?！?原代培養(yǎng)（primary culture） 取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。,（3）代與細胞周期？,◆ 代（subculture generation）：指從細胞分離接種到分離再培養(yǎng)時的一

5、段時間；通常細胞要分裂3～5次，傳一次即一代?！?細胞世代（generation）：一個cell cycle,●原代培養(yǎng)細胞的生命歸宿●培養(yǎng)細胞的生命期(life span of culture cells),★ 原代培養(yǎng)期★ 傳代期★ 衰退期,☆ 有限細胞系？☆ 無限細胞系？,◆原代培養(yǎng)期,也稱初代培養(yǎng)期，指從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代的階段，一般持續(xù)1－4周。此期細胞移動比較活躍，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)

6、細胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細胞的遺傳性狀互不相同，細胞相互依存性強。初代培養(yǎng)細胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細胞和體內(nèi)細胞性狀相似性大，是檢測藥物很好的實驗對象。,◆傳代期,原代細胞生長一定時間后，貼壁型細胞就會連接成片而鋪滿瓶底，需要將原代細胞分開至多個新的培養(yǎng)瓶中，這個過程叫傳代。傳代后的細胞稱細胞系（初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代后便改稱做細胞系（Cell Line

7、）） 。此期的細胞系生長過程中持續(xù)時間最長，細胞增殖旺盛并維持二倍體核型。為保持二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在原代培養(yǎng)或傳代后早期凍存。,此期細胞仍生存，但不增殖或增殖很慢，最后衰退死亡。在細胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標志之一是細胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Mali

8、gnancy）。細胞永生性也稱不死性，即細胞獲持久性增殖能力，這樣的細胞群體稱無限細胞系（Infinite Cell Line），也稱連續(xù)細胞系（Continuous Cell Line）。無限細胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）.細胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細胞也可能具有惡性性質(zhì)。,◆衰退期,培養(yǎng)細胞生命期,◆ 每代細胞的生長過程,所有體外培養(yǎng)的細胞包括

9、原代培養(yǎng)和各種細胞系（株），生長達到一定的密度后都要做傳代處理。傳代的頻率和間隔與接種細胞數(shù)量、細胞生物學性質(zhì)以及營養(yǎng)液性質(zhì)等有關(guān)。細胞一代指從細胞培養(yǎng)接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。每代細胞一般要經(jīng)過三個生長階段：潛伏期、指數(shù)生長期和停止期。,細胞接種擴新的培養(yǎng)器皿后，胞質(zhì)回縮，胞體五圓球形，先懸浮于培養(yǎng)液中，稍后開始附著于底物，逐漸恢復原來的狀態(tài)。此時細胞具有代謝及運動功能，但無增殖發(fā)生。以后出現(xiàn)細胞分裂并逐漸增多而進入指數(shù)生長期。

10、,◆ 潛伏期,◆ 指數(shù)生長期,又稱對數(shù)期，此期細胞增殖旺盛，成倍增長，活力最佳，適用于進行實驗研究。一般可持續(xù)3－5d。,◆ 停止期,又稱平臺期，此期細胞已將其支持物表面占滿，細胞活力減弱，已不再進行分裂增殖。此時應進行傳代培養(yǎng)，將細胞接種到新的培養(yǎng)器皿中，開始再次繁殖，進入新的一代。,停止期,細胞一代,（4）細胞系？,◆ 細胞系（cell line） 初（原）代培養(yǎng)物第一次傳代培養(yǎng)后的細胞，即稱之為細胞系?！?有限細

11、胞系（finite cell line） 細胞系的生存期有限，不能連續(xù)傳代培養(yǎng)，大多為二倍體細胞。（Hayflick界限）◆ 無限（連續(xù)）細胞系（infinite cell line） 已獲得無限增殖能力能持續(xù)生存、連續(xù)傳代的細胞系。大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型。,（5）細胞轉(zhuǎn)化（transformation）,◆ 細胞轉(zhuǎn)化 正常細胞在致變因素作用下，發(fā)生了遺傳型改變和表型的變化（涉及DNA或基因的改

12、變）。細胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后的性狀可代代相傳。 可分為：自發(fā)轉(zhuǎn)化（原因不明） 人工誘變（物理、化學、生物誘變劑）◆ 一般轉(zhuǎn)化：細胞獲得不死性，尚無惡性 ◆ 惡性轉(zhuǎn)化：有致瘤性 不僅能自主增殖，還呈現(xiàn)侵襲性生長和轉(zhuǎn)移性。,細胞轉(zhuǎn)化或基因突變不一定就是癌變！,（6）細胞克隆與細胞株,◆ 細胞克?。╟ell clone） 由單個細胞通過有絲分裂形成的細胞群體?！?細

13、胞株（cell strain ） 通過選擇法或克隆形成法，從原代培養(yǎng)物或細胞系中獲得的穩(wěn)定的具有特殊性質(zhì)或標志的培養(yǎng)物。 如：溫度敏感突變株,Section 1：培養(yǎng)細胞的生物學特征,◆ 動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念◆ 動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史◆ 動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,二、動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史,動物細胞培養(yǎng)之創(chuàng)始,1907，美國的哈里森使用蓋玻片懸滴培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織細胞,蛙胚延髓組織培養(yǎng)在青蛙淋巴

14、凝塊內(nèi),1885年Roux最早嘗試使組織離體培養(yǎng)，材料是雞胚神經(jīng)板，采用生理鹽水為培養(yǎng)液，并首次采用組織培養(yǎng)這個術(shù)語。1907年Harrison 和1912年Carrel開始把組織培養(yǎng)作為一種方法，用于研究離體動物細胞的培養(yǎng)。由于組織培養(yǎng)在醫(yī)學研究中的應用，如抗病毒疫苗的生產(chǎn)等，現(xiàn)已經(jīng)逐漸發(fā)展成為一門精細技術(shù)。許多細胞株、細胞系的培育成功，尤其是以人的腫瘤組織為材料建立的各種細胞系，如HeLa細胞系（Gay，1952），可用來進行一

15、系列研究，更加促進了組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展。,,,,⑴ 理化環(huán)境可控制。⑵ 細胞經(jīng)培養(yǎng)后形成的細胞系和細胞株，特征均一。⑶ 培養(yǎng)物可直接被觀測。⑷ 提供大量均一的細胞供制備用。⑸ 便于進行人工篩選。⑹ 結(jié)合電影技術(shù)，可觀察細胞代謝活動和反應。廣泛應用于病毒學，免疫學，遺傳學，腫瘤學，分化及發(fā)育，細胞毒理試驗，生物技術(shù)等各個領(lǐng)域。,細胞培養(yǎng)的優(yōu)點,細胞培養(yǎng)的缺點,現(xiàn)人工模擬體內(nèi)環(huán)境的技術(shù)已經(jīng)很高, 但, 人工所模擬的條件與

16、體內(nèi)實際情況 仍不完全相同. 當細胞被置于體外培養(yǎng)后, 生活在缺乏動態(tài)平衡的環(huán)境中, 久了，必然發(fā)生變化.,◆ 與體內(nèi)主要不同 相對孤立、相對單一 缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié) 和細胞相互間的影響,◆ 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài) 分化減弱或不顯；細胞趨向單一化； ◆ 提示 要正確認識體外培養(yǎng)細胞 是一種特定條件下生長的細胞群體。,Section 1

17、：培養(yǎng)細胞的生物學特征,◆ 動物細胞與組織培養(yǎng)基本概念◆ 動物細胞與組織培養(yǎng)發(fā)展歷史◆ 動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,三、動物細胞特點及其體外培養(yǎng)特性,,,1. 體外培養(yǎng)細胞的生長條件,環(huán)境無毒和無菌；適宜的溫度；人和哺乳動物培養(yǎng)細胞最適溫度均為35－37℃。氣體環(huán)境和氫離子濃度；需要一定量的O2（1995－9975pa）和CO2（95％空氣+5%CO2）；pH7.2-7.4滲透壓；260－320mOsm/kg適用于大多數(shù)細胞

18、營養(yǎng)物質(zhì)；六碳糖是主要的能源物質(zhì)，還需要12種基本氨基酸和谷胺酰胺等,2.體外培養(yǎng)細胞的分型,根據(jù)形態(tài)特征分類貼壁型 上皮細胞型 成纖維細胞型 游走細胞型 多形細胞形懸浮型 懸浮在溶液中,體外細胞培養(yǎng)物的生長類型,按生長方式：主要分兩型 1）貼附型細胞:附著在某一固相支持物表面才 能生長的細胞。 2）懸浮型細胞:不必附著于固相支持物表面，而 在懸浮狀態(tài)

19、下即可生長的細胞。 絕大多數(shù)有機體細胞屬貼附型細胞， 只有少數(shù)細胞類型如某些腫瘤細胞和白細胞 可在懸浮狀態(tài)下生長,貼附是有機體細胞在體內(nèi)生存和生長發(fā)育的基本方式，包括細胞與細胞之間的相互接觸和細胞與細胞外基質(zhì)之間的相互接觸兩種方式。體外培養(yǎng)時大多數(shù)細胞仍然保持了這種特性，必須貼附在一定的支持物上才能生長。根據(jù)體培養(yǎng)細胞在支持物上貼附生長時的形態(tài)，大致分為四種類型：包括上皮細胞型（epithelium）、成纖

20、維細胞型（fibroblast）、游走細胞型（wandering）、多形細胞（polymorphiet）,1）貼壁依賴型（貼壁細胞）,細胞培養(yǎng)時呈扁平的不規(guī)則多角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密連接成單層細胞片，如皮膚表皮細胞、肝細胞、胰臟細胞和肺泡上皮細胞的培養(yǎng)細胞。,上皮細胞,細胞貼壁后呈梭形或不規(guī)則三角形，中央有圓形核，胞質(zhì)向外伸出2－3個長短不同的突起，生長時呈放射狀或火焰狀。除真正的成纖維細胞外，心肌、成骨肌細胞培養(yǎng)時均屬這

21、一類型。,成纖維細胞型,細胞質(zhì)常伸出偽足或突起，呈活躍的游走或變形運動，貼附于支持物上散生，一般不連接成片。單核細胞、巨噬細胞及某些腫瘤細胞在體外培養(yǎng)常呈現(xiàn)此種形態(tài)。,游走細胞型,多形型細胞,生長時像神經(jīng)細胞呈多角形，并伸出較長的神經(jīng)纖維，很難確定它們的形狀。體外培養(yǎng)時常見的多形型細胞是神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。,,也稱非貼壁型，這類細胞培養(yǎng)時不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長。來源于血液、淋巴組織的細胞，許多腫瘤細胞等均屬于此類，細胞

22、一般呈球形。,2）懸浮型,優(yōu)點 生存空間大，提供數(shù)量大 傳代方便(不需消化)； 易于收獲 可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點 觀察不方便； 很多細胞不能懸浮生長,3）兼性貼壁細胞,動物細胞培養(yǎng)中，有些細胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細胞、小鼠L929細胞等。,◆貼附生長型細胞的形態(tài)不穩(wěn)定,條件改變，細胞形態(tài)可有變化,◆培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定血清 Hela 高

23、血清 低血清 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 pH Hela 太酸或太堿 標準pH 成纖維細胞樣 上皮樣細胞 細胞密度 3T3 低密度 高密度 成纖維細胞樣

24、 上皮樣細胞 生長狀態(tài)改變 懸浮或貼附 懸浮 貼附 圓形 成纖維或上皮樣 轉(zhuǎn)化與否 未轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化后 成纖維樣 可成上皮樣,3、體外培養(yǎng)細胞的生長特點,1）貼

25、附,細胞貼壁過程,2）接觸抑制和密度抑制,定義：細胞從接種到長滿底物表面后，由于細胞繁殖數(shù)量增多相互接觸后，不再增加。,4、培養(yǎng)細胞的生長與增殖過程,1）單個細胞的生長過程,2）細胞系的生長過程,★ 原代培養(yǎng)期★ 傳代期★ 衰退期,培養(yǎng)群體細胞的生命期,3）每代細胞的生長過程,◆ 潛伏期（Latent phase）： 細胞從接種到貼壁生長繁殖的一段時間。二倍體細胞該期時間長（24~96h）；連續(xù)細胞系時間短（10~3

26、0min）。,● 細胞附著于底物上，游離期 結(jié)束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等● 血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質(zhì)），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。,◆ 指數(shù)生長期（Logarthmic growth phase）： 細胞增殖最旺盛時期，一般用細胞分裂指數(shù)（Mitotic ind

27、ex，MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細胞分裂指數(shù)介于0.1~0.5%，且受細胞種類培養(yǎng)液成分、pH、溫度等影響。,細胞數(shù)隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究,指數(shù)生長期是細胞活力最好的時期，在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)生長期持續(xù)3-5d后，隨細胞數(shù)量不斷增多，生長空間日趨減少，細胞相互接觸匯合成片，呈現(xiàn)接觸抑制（Contact inhibition）。而惡性細胞則無接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可

28、作為區(qū)分正常與癌細胞標志之一。癌細胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制（Density inhibition）,◆ 停止期（平臺期）,細胞達飽和密度, 可存活 仍有代謝活動，但基本不分裂， 細胞數(shù)量維持在某一水平上， 生長 活動停滯,機制：接觸抑制、密度依賴性,5、培養(yǎng)細胞的遺傳學特征,二倍體細胞異倍體干系標記染色體巴氏小體Y小體,6、體內(nèi)外細胞的差異

29、,總體：與體內(nèi)仍有相似-- 體外培養(yǎng)的細胞仍存在細胞和細胞、 細胞和基質(zhì)的相互關(guān)系但有不同 相對孤立、相對單一 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài) 分化減弱或不顯,◆ 培養(yǎng)的細胞之間 仍有在形態(tài)和機能上的相互依存關(guān)系。 在結(jié)構(gòu)上，如：上皮細胞仍見有橋粒 在生理活動上，單個細胞雖能生長繁殖,但不如群體細胞能力強，當相鄰細胞接觸，便導致運動停止◆ 培養(yǎng)的