實驗八、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉化

1、實驗八 大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉化,實驗目的,1.了解轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。2.學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的方法。3.學習將外源質粒 DNA 轉入受體菌細胞并篩選轉化體的方法。,實驗原理,轉化( Transformation )是將異源 DNA 分子引入另一細胞品系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究的基本實驗技術。,轉化中的受體細胞,轉化過程所用的受體

2、細胞一般是限制性修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株，常用 RM 符號表示。,轉化方法：電擊法、 CaCl2、 RuCl等化學試劑法感受態(tài)細胞：的處理后，細胞膜的通透性發(fā)生變化，成為能容許外源 DNA 分子通過時細胞的狀態(tài)。轉化細胞(轉化子)：帶有異源 DNA 分子的受體細胞( Transformant )。,實驗原理,實驗原理,本實驗以 E.coli DH5α 菌株為受體細胞，用 CaCl2 處理受體菌使其處

3、于為感受態(tài)，然后與 pUC18質粒共保溫，實現轉化。 pUC18質粒攜帶有抗氨芐青霉素的基因，因而使接受了該質粒的受體菌具有抗氨芐青霉的特性，用 Apr符號表示。將經過轉化后的全部受體細胞經過適應稀釋，在含氨芐青霉素的平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，只有轉化體才能存活，而未受轉化的受體細胞則因無抵抗氨芐青霉素的能力而死亡。,,,,,,,抗Amp,,,宿主細菌,,,,,,,含Amp培養(yǎng)基,影響轉化率的因素,細胞生長狀態(tài)和密度。 轉化的質粒 DNA 的

4、質量和濃度。 試劑的質量。 防止雜菌和其它外源 DNA 的污染。,實驗儀器,超凈工作臺,臺式高速冷凍離心機,恒溫空氣搖床,恒溫培養(yǎng)箱,培養(yǎng)皿,實驗試劑,大腸桿菌DH5α  LB培養(yǎng)基，  0.1mol/LCaCl2溶液（預冷）  氨芐青霉素 pUC18質粒,實驗步驟,菌株活化 感受態(tài)細胞制備 外源DNA的轉化,實驗步驟,菌株活化用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5α，在LB培養(yǎng)基平板

5、表面劃線，于37℃培養(yǎng)16小時挑取一個單菌落，轉到3－5ml LB培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)3－5小時將培養(yǎng)液全部轉到100ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)2－3小時，到OD600＝0.3－0.4,實驗步驟,感受態(tài)細胞制備將培養(yǎng)液轉入1.5ml離心管中，在冰上放置15－30min4000rpm離心5min,棄上清加入0.8ml預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，冰上預冷10min4000rpm離心5 min,棄上清加入0.2m

6、l預冷的0.1mol/l CaCl2,懸浮沉淀，即可使用。也可加入總體積15％的甘油 可－70℃長期保存,實驗步驟,轉化 取目的DNA加入大腸桿菌感受態(tài)細胞中，于冰上放置30min 于42℃水浴90S冰上放置2min加入800μl LB液體培養(yǎng)基于37培養(yǎng)1小時將培養(yǎng)液均勻涂布在含Amp+的培養(yǎng)基平板上將平板放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-14個小時，然后觀察結果,對照組,對照組1: 以同體積的無菌雙蒸水代

7、替DNA溶液,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。 對照組2: 以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。,轉化率,統計每個培養(yǎng)皿中的菌落數。 　　轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下： 　　轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反

8、應原液總體積／涂板菌液體積 　　轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg) 　　感受態(tài)細胞總數＝對照組２菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／涂板菌液體積 　　感受態(tài)細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態(tài)細胞總數,,實驗結果,實驗報告,寫明實驗目的、實驗原理、儀器、材料與試劑詳細列出實驗步驟；畫出實驗結果的示意圖并做分析，計算轉化效率。,1. 在制備感受態(tài)細胞的實驗中要注意哪些