吸收光譜法及熒光分析法

1、吸收光譜法及熒光分析法,主講：易有榮,吸收光譜法,吸收光譜法是根據(jù)物質對不同波長的光具有選擇性吸收而建立起來的一種分析方法。它既可對物質進行定性分析也可定量測定物質含量。包括紫外、可見光及紅外吸收光譜等。如果在測定時利用單色器獲得的單色光來測定物質對光的吸收能力，則稱為分光光度法。 人眼能產(chǎn)生顏色的光區(qū)稱可見光區(qū)，其波長范圍為380-760nm。近紫外光區(qū)的波長范圍為200-380nm。,,吸收光譜法,紫外-可見光光分光光度法是

2、根據(jù)物質分子對200-760nm光區(qū)的吸收特性而進行分析的方法，其特點是： 1)靈敏度高，能測定生物試樣中的微量物質。 2）選擇性強，由于組分的分子結構不同，它們的吸收光譜不同，因此只要選擇適當?shù)姆蛛x步驟和實驗條件，就可以進行生物試樣中的單組分和多組分的測定。 3 ) 精密度和準確度較高。 4 )儀器設備簡單，操作易掌握。定性能力較弱，通常還需與紅外、色譜、質譜等技術結合才能作出可靠的定

3、性鑒定。,,物質對光的選擇性吸收,太陽或白火只燈（鎢燈）發(fā)出的可見光，是一種由許多不同波長的光所組成的寬廣光譜，若將它通過三棱鏡分光，則可看到紅、橙、黃、綠、青、藍、紫等顏色。可見，白光是混合光，它是由多種不同波長范圍的單色光按一定比例混合而成的。如果把兩種適當顏色的光按一定比例混合也可得到白光，則這兩種顏色互稱為互補色。物質對光具有選擇性吸收的能力。同一物質對不同波長光的吸收能力不同，不同物質對同一波長光的吸收能力也不同。物質所呈現(xiàn)

4、的顏色正是由于它對光的選擇性吸收而產(chǎn)生的。,,物質對光的選擇性吸收,當一束光照射到某一物質的溶液時，若該溶液對可見光譜中各種顏色的光都不吸收則溶液呈透明無色狀；若幾乎全部吸收則溶液呈黑色；若對各種顏色的光都能均勻吸收一部分則溶液呈灰色。若溶液對其中某些波長的光吸收較多，透過較 少；而對另一些波長的光吸收較少，透過較多，則溶液就呈現(xiàn)這種吸收較少透過較多的光的顏色，即溶液的顏色是它所吸收色光的互補色。 例如；KMNO4的水溶液選擇性

5、吸收可見光中的大部分黃綠色光，故呈紫色； 硫酸銅溶液選擇性吸收黃光而呈藍色。,,物質顏色與吸收光顏色、波長的關系,物質顏色 吸收光顏色 吸收光波長（nm） 黃綠 紫色 400－450 黃色 藍色 450－480 橙色 綠色 480－490

6、 紅色 藍綠色 490－500 紫紅色 綠色 500－560 紫色 黃綠 560－580 藍色 黃色 580－600 藍綠色 橙色 600－650 藍綠色

7、 紅色 650－750,,吸收光譜,如果測量某種物質對不同波長光的吸收程度，以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，則可得到一條曲線，稱為吸收曲線，也稱可見－紫外吸收光譜，它能清楚地描述物質對光的吸收情況。由于有機化合物發(fā)色團和助色團的種類、數(shù)目及其在分子中所處的位置和環(huán)境不同，因此測到的吸收光譜不相同。依據(jù)物質吸收光譜的形狀和特征可作該物質的鑒別、純度檢查和初步結構分析。,,光吸收的基本定律； 朗伯－比爾定律

8、,紫外-可見光吸收光譜的最主要用途是定量分析，即通過吸收光譜選擇一個或幾個測定波長，測定試樣中一個或幾個組分的含量。紫外-可見光吸收光譜定量分析的基礎是朗伯－比爾定律。它說明了吸光物質對單色光吸收的程度與該物質的濃度與厚度之間的關系，是吸收光譜的基本定律。 當單色光通過厚度一定、均勻的吸收溶液時，該溶液對光的吸收程度與溶液中物質的濃度C成正比，即A=KBC,,光吸收的基本定律； 朗伯－比爾定律,K為吸光系數(shù)，B為溶液的厚度，C為吸光

9、物質的濃度K與物質的性質、溫度、入射光的波長等有關。上式的物理意義為；當一束平行的單色光通過均勻透明溶液時，該溶液對光的吸收程度與溶液中物質的濃度和光通過液層厚度的乘積成正比。,,吸收光譜的應用,只要被測物質在紫外－可見－近紅外波段由吸收光譜，就可用光譜分析法來定性和定量分析。 1） 定性分析；比較光譜的一致性，與其它方法結合進行分析。 2）定量分析；,,標準曲線法,配制與被測組分相同的一系列標準溶液，在與被測組分相

10、同的最大吸收波長下，測定各標準溶液的A值。以A值為縱坐標，以濃度C為橫坐標,繪出濃度－吸光度關系曲線，就是標準曲線。將樣品溶液在相同條件下測定A值，在縱坐標上找出與A值相對應的濃度即為樣品的濃度。,,標準曲線法,理想的標準曲線應該是；不同濃度的標準溶液所測得的吸光度對濃度作圖時，是一條斜率接近于1且通過原點的直線。標準溶液的濃度范圍應在被測物質濃度的一半到兩倍之間。吸光度在0、05－1、0之間。繪制標準曲線至少應由五個點，每個點由兩

11、個以上的重復值，曲線不能任意延長。,,利用標準管計算測定物含量；,將標準與樣品分別在相同條件下顯色，測定其吸光度，因是相同物質在相同條件下測定，故可按下式計算樣品的濃度；A樣/A標＝KC樣L/KC標L A樣/A標＝C樣 /C標此法適和A-C線性關系良好且通過原點的情況。,,紫外分光光度計的基本結構,光源單色器吸收池檢測器信號顯示系統(tǒng),,紫外分光光度計的基本結構—光源,必須具有

12、穩(wěn)定的、有足夠強度的連續(xù)光譜，并經(jīng)聚光鏡使之成為平行光。普通白熾燈（鎢燈）可用以提供可見光光源，其光譜范圍為320－2500nm氫弧燈（氫燈）的常用燈為低壓氫燈，具有石英窗，能提供紫外光，光譜為180－375nm,但實際應用于360nm下。,,紫外分光光度計的基本結構—單色器,它是分光計的心臟部分，是一種將來自于光源的混合光分解為單色光，并能任意改變波長的裝置，包括分光系統(tǒng)、光路狹縫、波長調節(jié)器等部件。分光系統(tǒng)－有棱鏡和光柵兩種，使

13、光源色散產(chǎn)生寬廣光譜。,,紫外分光光度計的基本結構—單色器,a、棱鏡：有玻璃和石英制成，b、光柵：在石英或玻璃上刻上許多等距離的平行線（一般每毫米上千條），通過光的“干涉”而分成光譜。c、狹縫：分入光狹縫和出光狹縫。一般兩者寬度一致。狹縫愈窄，光束波愈純。狹縫寬度常以毫米表示。d、波長調節(jié)器：一般是調節(jié)準直鏡位置以選擇分光光譜的波長。,,紫外分光光度計的基本結構—吸收池,比色杯有不同規(guī)格和形狀，玻璃比色杯用于可見光光度測定，石英比

14、色杯用于紫外分光光度測定也可用于可見光。吸收池僅有兩面透光具有光學性質;另兩面以磨沙玻璃為材料以示區(qū)別，比色杯的光學表面不能有任何污染。每次使用完畢，立即到空然后用水清洗3－4次最后可用甲醇沖洗;用蘸有洗滌劑的海綿清洗效果較好。如果以上步驟無效時，可將比色杯在50％硝酸中短時浸泡，再用水充分沖洗。,,紫外分光光度計的基本結構—檢測器,其主要作用是接受透射光信號變成電能，必要時加以放大。有三種類型；光電池、光電管、光電倍增管,,紫外

15、分光光度計的基本結構,信號顯示系統(tǒng)：,,Lambda25型紫外主要功能及應用范圍,Lambda25型紫分光光度計 主要功能及應用范圍,能定性定量測定所有再190n-1100nm波長范圍內有吸收的化合物。1）  波長掃描功能：用于定性分析。2）波長編程功能：可同時測量2-8個波長點的OD值。3）  時間掃描功能：用于動力學研究。 4)濃度測定功能：用于定量分析。,,紫外吸收法測定核酸含量,原

16、理：核苷、核苷酸、核酸的組成成分中都含有嘌呤、嘧啶堿基，這些堿基都具有共軛雙鍵（－C=C-C=C-），能強烈吸收250－290nm的紫外光，其最大吸收在260nm左右。,,紫外吸收法測定核酸含量,在定性鑒定各類核苷酸物質時，先測定它們在幾個特定波長的紫外吸收值，然后根據(jù)A250/A260、A280/A260、A290/A260比值，來判定是哪一種核苷酸。在定量測定時，可根據(jù)在特定波長（一般在260nm）的紫外吸收值計算含量。,,紫外吸收

17、法測定核酸含量,另外旦白質液具有紫外吸收，其吸收高峰在280nm處，在260nm處吸收值僅為核酸的1/10或更低。因此對于含有微量蛋白質的核酸樣品測定誤差小，根據(jù)核酸在260nm和280nm吸收比值可判定核酸的純度，,,紫外吸收法測定核酸含量,RNA的純度A260/A280應該為2以上，若小于2表示可能有蛋白質污染DNA的純度A260/A280應該為1.8,若小于1.8表示可能有蛋白質或酚污染；大于1.8表示可能有RNA污染。,,紫外

18、吸收法測定蛋白質的含量,原理：由于蛋白質中駱氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有紫外吸收特性，吸收峰在280nm處，在此波長時，蛋白質溶液的吸光度A280與其含量成正比關系，可用作定量測定。,,紫外吸收法測定蛋白質的含量,由于核酸在280nm也有吸收，對蛋白質測定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm若同時測定260nm的光吸收，則通過計算可消除核酸對蛋白質的影響。,,紫外吸收法測定蛋白質的含量,其缺點是當待測蛋白質

19、與標準蛋白質中的駱氨酸和色氨酸殘基含量差異較大時會產(chǎn)生一定的誤差，不同的蛋白質和核酸的紫外吸收是不同的，即使經(jīng)過校正，測定結果還存在一定誤差。因此紫外吸收法僅作為初步定量依據(jù)。蛋白質濃度（mg/ml）=1.45A280-0.74A260蛋白質濃度（mg/ml0=1.55A280-0.76A260,,GENios多功能酶標儀主要功能,集多種檢測于一體 光吸收（Absorbance）-紫外及可見光（230－1000

20、nm） 紫外可見熒光測定（230－700nm） 生物連續(xù)發(fā)光測定、化學連續(xù)發(fā)光測定兼容多種樣品模式 6－1536微孔板、PCR管、比色杯頂部與底部閱讀，貼壁細胞和帶蓋樣品選用底部讀數(shù) 結果更準確多達32塊濾光片的光路設計廣泛地用途 DNA、RNA、旦白質光吸收和熒光定量 ELISA及熒光ELISA實驗、報告基

21、因實驗（Luciferase）、細胞學相關研究等,,Magellan包含6種主要向導類型,酶標儀的操作軟件Magellan包含6種主要向導類型；并由向導引導操作者自動完成儀器操作。其向導類型由：獲得原始數(shù)據(jù)：通過設置參數(shù)和啟動測量快捷得到原始數(shù)據(jù)。運行一個方法；根據(jù)已定義的方法操作儀器。結果求值：可查看原始數(shù)據(jù)并獲得原始數(shù)據(jù)和運行一個方法獲得結果求值。創(chuàng)建/編輯一個方法；定義和編輯一個方法該方法包含必要的測量參數(shù)、結果求

22、值、數(shù)據(jù)處理。創(chuàng)建/編輯樣本ID列表：雜項：,,熒光分析法,熒光分析法,基本原理    某些物質的分子能吸收能量而發(fā)射出熒光，根據(jù)熒光的光譜和熒光強度，對物質進行定性或定量的方法，稱為熒光分析法（fluorescence analysis）。    熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強、需樣量少和方法簡便等優(yōu)點，它的測定下限通常比分光光度法低2~4個數(shù)量級。,,熒光分析法,

23、熒光分析法的應用范圍熒光分析在醫(yī)學檢驗、生物醫(yī)學、藥物血濃、環(huán)境監(jiān)測、食品分析應用較多。主要用于胺類如組織胺、多巴胺，甾族化合物、DNA、RNA、酶、輔酶、青霉素、連霉素維生素、強心甙、麻醉劑。,,熒光分析法,熒光分析法是測定物質吸收了一定頻率的光以后，物質本身所發(fā)射的光的強度。物質吸收的光，稱為激發(fā)光；物質受激后所發(fā)射的光，稱為發(fā)射光或熒光。如果將激發(fā)光用單色器分光后，連續(xù)測定相應的熒光的強度所得到的曲線，稱為該熒光物質的激發(fā)光

24、譜（excitation spectrum）。,,熒光分析法,實際上熒光物質的激發(fā)光譜就是它的吸收光譜。在激發(fā)光譜中最大吸收處的波長處，固定波長和強度，檢測物質所發(fā)射的熒光的波長和強度，所得到的曲線稱為該物質的熒光發(fā)射光譜，簡稱熒光光譜（fluorescence spectrum）。在建立熒光分析法時，需根據(jù)熒光光譜來選擇適當?shù)臏y定波長。激發(fā)光譜和熒光光譜是熒光物質定性的依據(jù)。,,熒光分析法,對于某一熒光物質的稀溶液，在一定波長和一定強

25、度的入射光照射下，當液層的厚度不變時，所發(fā)生的熒光強度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎。熒光物質的線性范圍一般在0.00005-100微克/ml,當熒光物質溶液的吸光度小于或等于0.05時熒光強度和濃度才成線性關系。當高濃度時，由于自粹滅和自吸收使熒光強度和濃度不呈線性關系，發(fā)生負偏差。因此分析時注意在校正曲線的線性范圍內進行。,,熒光分析法,熒光儀的主要部件    測定熒光可用熒光計和熒光

26、分光光度計，二者的結構復雜程度不同，但其基本結構是相似的。由光源發(fā)出的光，經(jīng)單色器讓特征波長的激發(fā)光通過，照射到液槽使熒光物質發(fā)射出熒光，經(jīng)第二個單色器讓待測物質所產(chǎn)生的特征波長熒光通過，照射到檢測器產(chǎn)生光電流，經(jīng)放大后以指針指示或用記錄儀記錄其信號。,,熒光分析法,儀器的主要部件如下：光源：發(fā)射紫外區(qū)和可見區(qū)的激發(fā)光，一般常用的為溴鎢燈和汞蒸汽燈，以及氙弧燈。單色器：儀器共有兩個單色器，作用分別是濾去非特征波長的激發(fā)光，和濾去非特

27、征波長熒光的雜散光。液槽：用來盛放待測溶液。檢測器：檢測待測物質所發(fā)射的熒光信號。,,熒光分析法,熒光分析法的定性和定量（一）定性分析    熒光物質特性的光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜兩種。在分光光度法中，被測物質只有一種特征的吸收光譜，而熒光分析法能測出兩種特征光譜，因此，鑒定物質的可靠性較強。當然，必須在標準品對照下進行定性。,,熒光分析法,（二）定量測定    熒

28、光分析法的定量測定方法較多，可分為直接測定法和間接測定法兩類。直接測定法： 利用熒光分析法對被分析物質進行濃度測定，最簡單的便是直接測定法。某些物質只要本身能發(fā)熒光，只須將含這類物質的樣品作適當?shù)那疤幚砘蚍蛛x除去干擾物質，即可通過測量它的熒光強度來測定其濃度。具體方法有兩種。,,熒光分析法,直接比較法： 配制標準溶液的熒光強度Fx，已知標準溶液的濃度Cs，便可求得樣品中待測熒光物質的含量。 如果空白溶液的熒光強度

29、調不到零，則必須從Fs和Fx值中扣除空白溶液的熒光強度F0，然后進行計算。,,熒光分析法,標準曲線法： 將已知含量的標準品經(jīng)過和樣品同樣處理后，配成一系列標準溶液，測定其熒光強度，以熒光強度對熒光物質含量繪制標準曲線。再測定樣品溶液的熒光強度，由標準曲線便可求出樣品中待測熒光物質的含量。,,熒光分析法,間接測定法：有許多物質，它們本身不能發(fā)熒光，或者熒光量子產(chǎn)率很低，僅能顯現(xiàn)非常微弱的熒光，無法直接測定，這時可采用間接測定方法。

30、,,熒光分析法,間接測定方法有以下幾種：（1）化學轉化法：通過化學反應將非熒光物質變?yōu)檫m合于測定的熒光物質。例如金屬與螯合劑反應生成具有熒光的螯合物。有機化合物可通過光化學反應、降解、氧化還原、偶聯(lián)、縮合或酶促反應，使它們轉化為熒光物質。（2）熒光猝滅法：這種方法是利用本身不發(fā)熒光的被分析物質能使某種熒光化合物的熒光猝滅的性質，通過測量熒光化合物熒光強度的下降，間接地測定該物質的濃度。,,熒光分析法,減小測量誤差的方法（1）溶劑：

31、溶劑能影響熒光效率，改變熒光強度，因此，在測定時必須用同一溶劑。（2）濃度：在較濃的溶液中，熒光強度并不隨溶液濃度呈正比增長。因此，必須找出與熒光強度呈線性的濃度范圍。（3）酸度：熒光光譜和熒光效率常與溶液的酸度有關，因此，須通過條件試驗，確定最適宜的pH值范圍。,,熒光分析法,（4）溫度：熒光強度一般隨溫度降低而提高，因此，有些熒光儀的液槽配有低溫裝置，使熒光強度增大，以提高測定的靈敏度。在高級的熒光儀中，液槽四周有冷凝水并附有恒