高效液相色譜分析

1、復(fù)習(xí),2024/2/8,分離度R定義；為什么可用分離度R作為色譜柱的總分離效能指標(biāo)？能否根據(jù)理論塔板數(shù)來判斷分離的可能性？為什么？根據(jù)“相似相容”原理，色譜的流出規(guī)律？熱導(dǎo)檢測(cè)器適用范圍與工作原理？,色譜流出規(guī)律,分離非極性物質(zhì)，一般選用非極性固定液，各組分按沸點(diǎn)次序先后流出色譜柱，沸點(diǎn)低的先出峰，沸點(diǎn)高的后出峰。分離極性物質(zhì)，選用極性固定液，各組分按極性順序分離，極性小的先流出色譜柱，極性大的后流出色譜柱。分離非極性和極性

2、混合物時(shí)，一般選用極性固定液，這時(shí)非極性組分先出峰。對(duì)于形成氫鍵的試樣，如醇、酚、胺和水等，一般選用極性或氫鍵型固定液，各組分按與固定液分子間形成氫鍵能力大小先后出峰。,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,第三章高效液相色譜分析法,一、高效液相色譜法特點(diǎn)Characteristic of HPLC二、影響色譜峰擴(kuò)展及分離的因素The factors that influence peak expansion

3、 and sepration,high performance liquid chromatograph,§3-1概述,2024/2/8,,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,經(jīng)典LC與HPLC比較,2024/2/8,HPLC:采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測(cè)器,HPLC特點(diǎn)：高壓、高速、高效、高靈敏度、樣品回收方便,2024/2/8,GC與HPLC的比較,2024/2/8,與GC比較，HPLC

4、的優(yōu)點(diǎn),分析對(duì)象廣 氣相色譜只限于分析氣體和沸點(diǎn)較低的化合物；HPLC不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，適用于高沸點(diǎn)、熱穩(wěn)定性差、摩爾質(zhì)量大的物質(zhì)。原則上講，幾乎可以分析除永久氣體外所有的有機(jī)和無機(jī)化合物。 流動(dòng)相對(duì)分離起作用 氣相色譜的流動(dòng)相僅起運(yùn)載作用，對(duì)組分不產(chǎn)生相互作用力；HPLC的流動(dòng)相對(duì)組分產(chǎn)生相互作用力，相當(dāng)于增加了一個(gè)控制和改進(jìn)分離條件的參數(shù)。經(jīng)常在室溫條件下操作 氣相色譜法一般在較高溫度下進(jìn)行,2024

5、/2/8,缺點(diǎn)：儀器設(shè)備費(fèi)用昂貴，操作嚴(yán)格。,與GC相比，流動(dòng)相差別,GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無親合作用力，只與固定相作用 HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、 改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用流動(dòng)相種類較多，選擇余地廣流動(dòng)相極性和pH值的選擇也對(duì)分離起到重要作用 選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動(dòng)相 可以增大分離選擇性,2024/2/8,2024/2/8,,,

6、影響色譜峰擴(kuò)展及分離的因素,基本概念及基礎(chǔ)理論同氣相色譜：保留值、分配系數(shù)、分配比、分離度、選擇性因子(分離因子)、塔板理論及速率理論。由于流動(dòng)相的差別，對(duì)色譜過程必然產(chǎn)生影響。,2024/2/8,速率理論(與GC對(duì)比),GC:HPLC:,2024/2/8,速率理論(與GC對(duì)比),討論：1）流動(dòng)相流速對(duì)HPLC板高的影響(與GC對(duì)比)next2）渦流擴(kuò)散項(xiàng)及其影響 next,2024/2/8,速率理論(與G

7、C對(duì)比),2024/2/8,速率理論(與GC對(duì)比),3）傳質(zhì)阻抗項(xiàng)及其影響,2024/2/8,HPLC法中分離條件的選擇,1. 固定相與裝柱方法的選擇： 選粒徑小的、分布均勻的球形固定相（dp≤10μm） 首選化學(xué)鍵合相，勻漿法裝柱2. 流動(dòng)相及其流速的選擇： 選粘度小、低流速的流動(dòng)相——甲醇，1ml/min 3. 柱溫的選擇： 選室溫250C左右,2024/2/8,2024/2/8,第三章高效

8、液相色譜分析法,一、液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatograph二、液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatograph三、離子交換色譜ion-exchange chromatograph五、離子對(duì)色譜ion-pair chromatograph四、離子色譜ion chromatograph六、排阻色譜size- exclusi

9、on chromatograph,§3-2主要分離類型與原理,high performance liquid chromatograph,basic principle and main separating types,2024/2/8,一、液-液分配色譜liquid- liquid partition chromatography,固定相與流動(dòng)相均為液體（互不相溶）； 基本原理：組分在固定相和流

10、動(dòng)相上的分配； 流動(dòng)相：對(duì)于親水性固定液，采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定液的極性（正相 normal phase），反之，流動(dòng)相的極性大于固定液的極性（反相 reverse phase）。正相與反相的出峰順序相反； 固定相：早期涂漬固定液，固定液流失，較少采用； 化學(xué)鍵合固定相：（將各種不同基團(tuán)通過化學(xué)反應(yīng)鍵合到硅膠（擔(dān)體）表面的游離羥基上。C-18柱（反相柱）。,2024/2

11、/8,二、液-固吸附色譜liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固體吸附劑為，如硅膠、氧化鋁等，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑； 流動(dòng)相：各種不同極性的一元或多元溶劑。 基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸； 適用于分離相對(duì)分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對(duì)具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性； 缺點(diǎn)：非線形等溫吸附常引起

12、峰的拖尾；,2024/2/8,三、離子交換色譜ion-exchange chromatography,固定相：陰離子離子交換樹脂或陽離子離子交換樹脂； 流動(dòng)相：陰離子離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；陽離子離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液； 基本原理：組分在固定相上發(fā)生的反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時(shí)間長(zhǎng)； 陽

13、離子交換：R—SO3-Na+ +M+ = R—SO3-M+ + Na+ 陰離子交換：R—NR4+Cl- +X- = R—NR4+X- + Cl- 應(yīng)用：離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。,2024/2/8,四、離子對(duì)色譜ion pair chromatography,原理：將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子（對(duì)離子或反離子）加到流動(dòng)相中使其與溶質(zhì)離子結(jié)合形成疏水性離子對(duì)化合物

14、，使其能夠在兩相之間進(jìn)行分配； 陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對(duì)離子； 陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對(duì)離子； 反相離子對(duì)色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對(duì)離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動(dòng)相，試樣離子X-進(jìn)入流動(dòng)相后，生成疏水性離子對(duì)Y+ X -后；在兩相間分配。,2024/2/8,五、離子色譜ion chromat

15、ography,離子色譜是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)，其與離子交換色譜的區(qū)別是其采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測(cè)器，是測(cè)定混合陰離子的有效方法。,傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問題：(1)需要高濃度淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長(zhǎng)；(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法。,2024/2/8,1、離子色譜法原理,離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交換的不同點(diǎn)：采用交換容

16、量非常低的特制離子交換樹脂為固定相；細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用高壓輸液泵；,低濃度淋洗液或本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無機(jī)離子混合物；各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。,2024/2/8,2、離子色譜優(yōu)點(diǎn),（1）分析速度快 可在數(shù)分鐘內(nèi)完成一個(gè)試樣的分析；,（2）分離能力高 在適宜的條件下，可使常見的各種陰離子混合物分離；例：使用雙柱法，

17、在十幾分鐘內(nèi)，可使七種陰離子完全分離。,（3）分離混合陰離子的最有效方法（4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱,2024/2/8,3、離子色譜裝置類型 suppressed apparatus of IC,抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型 分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在0.01～0.05毫摩爾/克干樹脂。,非抑制型: 當(dāng)進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.007～0.07毫摩爾/克干樹脂),使用低濃度、低電離度的有

18、機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，不需抑制柱。,2024/2/8,離子色譜連續(xù)抑制裝置圖,2024/2/8,離子色譜連續(xù)抑制原理圖,2024/2/8,4、離子色譜的應(yīng)用 application of IC,陰離子分析: 雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3×250mm),流動(dòng)相：0.003mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO

19、3， 流量138 mL/hr。七種陰離子在20分鐘內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量在3～50 ppm。,2024/2/8,六、排阻色譜色譜size- exclusion chromatography,固定相：凝膠(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。 全部在

20、死體積前出峰； 可對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量在100-105范圍內(nèi)的化合物按質(zhì)量分離,2024/2/8,第三章高效液相色譜分析法,一、液相色譜固定相stationary phase of HPLC二、液相色譜流動(dòng)相 mobile phase of HPLC三、分離條件的選擇,§3-3 §3-4 液相色譜的固定相液相色譜的流動(dòng)相,high performance liquid chromat

21、ograph,stationary phase and mobile phase of HPLC,2024/2/8,一、液相色譜固定相 stationary phases of LC,1. 液-液分配及離子對(duì)色譜法固定相 （1）全多孔型擔(dān)體 由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見； 現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制

22、備柱填料；,（2）表面多孔型擔(dān)體 （薄殼型微珠擔(dān)體） 30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1 ～ 2μm的多孔硅膠。 表面積小，柱容量底；,2024/2/8,（3）化學(xué)鍵合固定相,化學(xué)鍵合固定相: 目前應(yīng)用最廣、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳鍵型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si — C 穩(wěn)定，耐水

23、、耐光、耐有機(jī)溶劑，應(yīng)用最廣； c. 硅碳鍵型： ≡Si—C d. 硅氮鍵型： ≡Si—N,2024/2/8,化學(xué)鍵合固定相的特點(diǎn),（1）傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；（2）壽命長(zhǎng)，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動(dòng)相沖擊； 耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定； （4）選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；（5）有利

24、于梯度洗脫；,存在著雙重分離機(jī)制：(鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定分離機(jī)理)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主；,2024/2/8,2.液-固吸附分離固定相,種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等； 結(jié)構(gòu)類型：全多孔型和薄殼型； 粒度：5～10 μm；,2024/2/8,3.離子交換色譜分離固定相,結(jié)構(gòu)類別：（1）薄殼型離子交換樹脂 薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂；（2）離子交

25、換鍵合固定相 薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)） 樹脂類別：（1） 陽離子交換樹脂（強(qiáng)酸性、弱酸性）（2） 陰離子交換樹脂（強(qiáng)堿性、弱堿性）,2024/2/8,4. 空間排阻分離固定相,（1）軟質(zhì)凝膠 葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)； 水為流動(dòng)相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質(zhì)凝膠 苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠； 非

26、極性有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質(zhì)凝膠 多孔硅膠、多孔玻珠等； 化學(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動(dòng)相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。 可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。,2024/2/8,二、液相色譜的流動(dòng)相 mobile phases of LC,1. 流動(dòng)相特性 （1）液相色譜的流動(dòng)相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成改變，

27、極性改變，可顯著改變組分分離狀況； （2）親水性固定液常采用疏水性流動(dòng)相，即流動(dòng)相的極性小于固定相的極性，稱為正相液液色譜法，極性柱也稱正相柱。 （3）若流動(dòng)相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。,2024/2/8,2. 流動(dòng)相類別,按流動(dòng)相組成分：?jiǎn)谓M分和多組分； 按極性分：極性、弱極性、非極性； 按使用方式分：

28、固定組成淋洗和梯度淋洗。 常用溶劑： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元組合溶劑作為流動(dòng)相可以靈活調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時(shí)間。,2024/2/8,3. 流動(dòng)相選擇,在選擇溶劑時(shí)，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)。 采用正相液-液分配分離時(shí)：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時(shí)間太短，降低溶劑極性，反之增加。 也可在低極性溶

29、劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時(shí)間縮短。 常用溶劑的極性順序： 水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六環(huán)> 四氫呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙酸乙酯> 乙醚> 異丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>

30、煤油(最小),2024/2/8,4. 選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題,（1）盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。,（2）避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。,（3）試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。,（4）流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。,2024/2/8,,2024/2

31、/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,第三章高效液相色譜分析法,一、高效液相色譜儀HPLC二、流程及主要部件general process and main assembly of HPLC,§3-5高效液相色譜的特點(diǎn)與儀器,high perform

32、ance liquid chromatograph,feature and instrument of HPLC,2024/2/8,一、液相色譜儀器 high performance liquid chromatograph,2024/2/8,液相色譜儀（2）,2024/2/8,液相色譜儀（3）,2024/2/8,液相色譜儀（4）,2024/2/8,二、流程及主要部件 process and main assembly of HPL

33、C,1.流程,2024/2/8,2.主要部件,(1) 高壓輸液泵主要部件之一，壓力：150～350×105 Pa。為了獲得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液體的流動(dòng)相高速通過時(shí)，將產(chǎn)生很高的壓力，因此高壓、高速是高效液相色譜的特點(diǎn)之一。應(yīng)具有壓力平穩(wěn)、脈沖小、流量穩(wěn)定可調(diào)、耐腐蝕等特性,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,(2)梯度

34、淋洗裝置,外梯度: 利用兩臺(tái)高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。,內(nèi)梯度: 一臺(tái)高壓泵, 通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。,2024/2/8,(3) 進(jìn)樣裝置,流路中為高壓力工作狀態(tài)， 通常使用耐高壓的六通閥進(jìn)樣裝置， 其結(jié)構(gòu)如圖所示：,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8

35、,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,(4) 高效分離柱,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)顆粒度越小：柱效越高(傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小) 柱壓越高(滲透性差)顆粒分布顆粒分布越寬∶柱效低(滲透性

36、差)顆粒形狀球型∶柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻 流動(dòng)相線性速度不均勻 譜帶擴(kuò)展,對(duì)HPLC柱的了解（一）,平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布大的孔徑可分析高分子量的分子鍵合相化學(xué)影響化合物的分離度：a 不同鍵合相對(duì)不同種類的化合物分離不同可能導(dǎo)致色譜的分離機(jī)理不同如：C18、C8、CN,對(duì)HPLC柱的了解（二）,含碳量含碳量越高，k‘值越

37、大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分離水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好有利于極性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗,不同色譜柱的含碳量,色譜柱C% k‘苊 (50/50的乙腈/水)Symmetry C181917Zorbax ODS1715.7LiChrosorb RP-181510.3Symmetry C81212.5Resolv

38、e C-181212.4Ultrasphere ODS1111.3Partisil ODS-31112.0mBondpak C-1810 7.9Nova-Pak C-18 7 5.5,對(duì)HPLC柱的了解(三),填料的端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1% - 1%）,殘基處理的效果,NovaPak C18,未封口 C18,① 抗壞血酸② 煙酰胺③ 對(duì)氨基苯甲

39、酸④ 哌咯西叮⑤ 核黃素⑥ 苯酚⑦ 鹽酸硫胺,對(duì)HPLC柱的了解（四）,硅膠的活性主要影響堿性化合物的保留行為：k'生產(chǎn)硅膠時(shí)處理溫度不同，硅膠活性也不同是選擇性差異的主要來源硅膠的雜質(zhì)含量重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志,對(duì)HPLC柱的了解（五）,填料的穩(wěn)定性硅膠填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2時(shí)鍵合相水解,新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱,Symmetr

40、y高純度硅膠：Fe，Al，Mg等均<10ppm 孔徑100A，5m球形顆粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面積：300 m2/g孔體積：1mL/g特點(diǎn)好峰形，好重現(xiàn)性，不同的選擇性，使用壽命長(zhǎng),Waters聚合物基質(zhì)的反相柱,特殊設(shè)計(jì)的多孔聚合物膠有很寬的 pH 適應(yīng)范圍（2-12）可用離子抑制方法分析堿性化合物有非常不同的選擇性柱效及韌性比相應(yīng)的硅膠柱低色譜機(jī)理不太清楚文獻(xiàn)背景低，用

41、戶少,色譜柱的規(guī)格,內(nèi)徑檢測(cè)的靈敏度樣品的容量長(zhǎng)度分離度，理論塔板數(shù)速度樣品的容量檢測(cè)的靈敏度,2024/2/8,采用ODS柱為固定相,甲醇-水為流動(dòng)相,用HPLC分離兩種弱堿性藥物(pKa=8~9),但分離效果不理想;主要表現(xiàn)為柱效能低,保留時(shí)間過短.試設(shè)計(jì)通過改變流動(dòng)相提高分離效能的方案.(10分),2024/2/8,(5) 液相色譜檢測(cè)器,a. 紫外檢測(cè)器 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

42、 特點(diǎn)： 靈敏度高； 線形范圍高； 流通池可做的很?。?mm × 10mm ，容積 8μL）； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長(zhǎng)可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。,2024/2/8,b. 光電二極管陣列檢測(cè)器,紫外檢測(cè)器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測(cè)器：1024個(gè)二極管陣列，各檢測(cè)特定波長(zhǎng)，計(jì)算機(jī)快速處理，三維立體譜圖，如

43、圖所示。,2024/2/8,2024/2/8,光電二極管陣列檢測(cè)器,2024/2/8,c. 熒光檢測(cè)器（fluorescence detector）,高靈敏度、高選擇性； 對(duì)多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；,2024/2/8,d. 示差折光檢測(cè)器（differential refractive index detector）,除紫外檢測(cè)器之外應(yīng)用最多的檢測(cè)器；

44、 可連續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；,通用型檢測(cè)器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）； 靈敏度低、對(duì)溫度敏感、不能用于梯度洗脫； 偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；,2024/2/8,示差折光檢測(cè)器,2024/2/8,液相色譜常用檢測(cè)器的一般性質(zhì),2024/2/8,一、影響分離的因素factors influenced separation二、分離類型的選擇c

45、hoice of separation types三、液相色譜的應(yīng)用application of HPLC四、液相制備色譜preparative liquid chromatography五、實(shí)際應(yīng)用過程注意事項(xiàng),§3-6 3-7 3-8影響分離的因素與操作條件的選擇,high performance liquid chromatograph,factors influenced separation and ch

46、oice of operation condition,第三章高效液相色譜分析法,2024/2/8,一、影響分離的因素 factors influenced separation,1. 影響分離的因素與提高柱效的途徑 在高效液相色譜中, 液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項(xiàng)B/U較小，可以忽略不計(jì)，即： H = A + C u 故液相色譜H-u

47、曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示。,2024/2/8,液體的黏度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。恒溫 改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。,2024/2/8,2.流速,流速大于0.5 cm/s時(shí), H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。但在實(shí)際

48、操作中，流量仍是一個(gè)調(diào)整分離度和出峰時(shí)間的重要可選擇參數(shù)。,3.固定相及分離柱 氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項(xiàng)技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。,2024/2/8,二、分離類型選擇 choice of separation types,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,2024/2/8,三、 HPLC

49、的應(yīng)用 application of HPLC,1. 環(huán)境中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量分析 固定相：薄殼型硅膠(37 ～50?m) 流動(dòng)相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色譜柱：50cm?2.5mm(內(nèi)徑) 檢測(cè)器：差示折光檢測(cè)器,可對(duì)水果、蔬菜中的農(nóng)藥殘留量進(jìn)行分析。,2024/2/8,有機(jī)氯農(nóng)藥毒性大、具持久性，正被特異性更高、

50、更易降解的有機(jī)磷農(nóng)藥和有機(jī)氮農(nóng)藥取代，但其熱穩(wěn)定性差，易在柱上降解?？捎酶咝б合嗌V檢測(cè)。例如，氨基甲酸酯農(nóng)藥是一類應(yīng)用范圍寬，藥效高，而對(duì)哺乳動(dòng)物毒性低的農(nóng)藥，隨著大量生產(chǎn)和應(yīng)用，對(duì)水環(huán)境造成了污染。由于它們熱穩(wěn)定性差，不適于用氣相色譜法測(cè)定，Anderson等在測(cè)定河水中的氨基甲酸酯時(shí)，先將樣品經(jīng)過填有反相 C18薄殼型填料的預(yù)柱，再進(jìn)人Altex Ultrasil－ ODS分析柱，以磷酸一乙酸緩沖溶液和甲醇的混合液為流動(dòng)相，用高靈

51、敏度的電化學(xué)檢測(cè)器測(cè)定，對(duì)滅害威、多菌靈等氨基甲酸酯的最低檢測(cè)質(zhì)量可達(dá)50－430pg。,2024/2/8,2. 稠環(huán)芳烴的分析,稠環(huán)芳烴多為致癌物質(zhì)。,固定相：十八烷基硅烷化鍵合相 流動(dòng)相：20%甲醇-水 ～100%甲醇 線性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 溫：50 ºC 柱 壓：70 ?104 Pa 檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器,2024/2/8,多

52、環(huán)芳烴類不易氣化，而在紫外或熒光檢測(cè)器上有靈敏的響應(yīng)，可消除或減少無紫外吸收或無熒光信號(hào)化合物的干擾，且在反相色譜柱中很好地分離，常用高效液相色譜法測(cè)定飲用水、地下水和江、河、湖水中的多環(huán)芳烴，用二氯甲烷或環(huán)己烷進(jìn)行萃取，將萃取液經(jīng)佛羅里硅土或硅膠色譜柱預(yù)分離，濃縮后注入ODS柱，用甲醇．水或乙睛，水為流動(dòng)相，分離各種多環(huán)芳烴，熒光或紫外分光光度檢測(cè)器檢測(cè)。也可將水樣經(jīng)高分子多孔材料如 AmberliteXAD－ 2、XAD－ 4、GD

53、X等富集，再適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?，濃縮后注入高效液相色譜分析。美國(guó)環(huán)保局的6440法采用Thk甲烷萃取水中的16種多環(huán)芳烴，萃取液經(jīng)干燥濃縮后，注入反相HC－ ODS Sil－ X色譜柱，用乙睛．水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，用紫外檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器鑒別測(cè)定。,2024/2/8,3. 水中酚類化合物,酚類化合物屬有毒有機(jī)污染物。水中痕量的酚類化合物易形成氯酚使飲水出現(xiàn)異味。我國(guó)水中優(yōu)先控制污染物黑名單中68種有毒污染物中6種為酚類。高效液相色譜測(cè)酚

54、類化合物可保持組成不變，無需衍生可直接測(cè)定，對(duì)不同取代和不同結(jié)構(gòu)的酚可同時(shí)分離分析且重現(xiàn)性好、靈敏度高、選擇性好。通常先將水樣酸化至pH＜ 4，再經(jīng)二氯甲烷、氯仿、乙醇等溶劑萃取或通過AmberliteXAD－2、XAD－4、GDX－502、上試401等高分子多孔樹脂進(jìn)行富集，再用乙醇等溶劑洗脫，濃縮后注入反相色譜柱，用甲醇．水．乙酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，用紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器測(cè)定。,2024/2/8,4.水中硝基化合物的分析,

55、硝基化合物是制造軍火的主要原料，軍火的生產(chǎn)和施用引起的硝基化合物對(duì)水環(huán)境的污染。由于其熱不穩(wěn)定性常用液相色譜法檢測(cè)。Maskarinec等用高效液相色譜法測(cè)定了水中硝胺類、硝基苯類和硝酸酯類炸藥。先用Porapak樹脂吸附富集水中痕量的硝基化合物，再用丙酮洗脫，濃縮后用乙酸鈉一氯乙酸緩沖溶液和丙酮的混合液為流動(dòng)相，用ZorbaxODS色譜柱分離，用靈敏的電化學(xué)檢測(cè)器定量測(cè)定，硝化甘油（NG）和季戊炸藥（PETN）的最低檢測(cè)質(zhì)量可達(dá)0．1

56、－0．4ng。,2024/2/8,5.水樣中無機(jī)物的分析,離子色譜可分析陰離子和陽離子。使用電導(dǎo)檢測(cè)器最低檢測(cè)質(zhì)量濃度為幾百μg/L，使用電化學(xué)檢測(cè)器最低檢測(cè)質(zhì)量濃度則可低達(dá)幾個(gè)μg/L。一次分析可同時(shí)測(cè)多種陰離子或陽離子，分析的靈敏度高，所用的樣品量小。若用富集柱，可將水樣富集可達(dá)到很低的檢測(cè)質(zhì)量濃度。使用磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，采用反相高效液相色譜法紫外檢測(cè)環(huán)境水樣中的硝酸鹽，最低檢測(cè)濃度可達(dá)0.7μg/L。一些金屬離子可與有機(jī)試劑形

57、成螫合物，經(jīng)反相高效液相色譜法分離后可用分光光度檢測(cè)器測(cè)定。另外，水樣中的砷和硒可用高效液相色譜與交流等離子檢測(cè)器和柱后氫化物發(fā)生器聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離檢測(cè)。,2024/2/8,四、制備型液相色譜 preparative liquid chromatography,獲得高純物質(zhì)（色譜純）的有效方法。 半制備柱（內(nèi)徑8mm，長(zhǎng)度15 ～ 30cm），一次制備量０.1～１mg；,1.色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 對(duì)分析柱：不影

58、響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量； 對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量； 超載：進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%為宜。,2024/2/8,2. 液相制備色譜的方法,收集組分時(shí)，通常有以下情況： （1）可獲得良好分離，主峰 使用制備柱，超載提高效率； （2）兩主成分之間的小組分； 超載，分離切分使待分離組分成為主

59、成分（富集）后，再次分離制備。,2024/2/8,3. 制備型液相色譜,制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大、進(jìn)樣量大、采用制備柱；柱后餾分收集器。 制備柱：內(nèi)徑20～50mm，柱長(zhǎng)50cm。,五、實(shí)際應(yīng)用過程注意事項(xiàng),1. 選HPLC參數(shù)時(shí)的基本考慮溶解度 - 選擇流動(dòng)相的條件分子量 - 在樣品預(yù)處理或GPC分析時(shí)有用官能團(tuán) - 有否離子化基團(tuán)? 保留特性如何? 樣品的基質(zhì) - 考慮如何前處理在基質(zhì)中樣

60、品的含量 - 分析、制備都考慮檢測(cè)特性 - 有否紫外吸收? 熒光?找出樣品中不同組份之間的差異摸索條件的重要線索,極性問題,2024/2/8,2. 對(duì)HPLC柱的了解,色譜柱的清洗,對(duì)所做的樣品要有充分的了解用對(duì)該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動(dòng)相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗,2024/2/8,,2

61、024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,2024/2/8,,3. 流動(dòng)相及樣品的預(yù)處理,液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相對(duì)的要求外，還有∶與檢測(cè)器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度細(xì)菌的生長(zhǎng),流動(dòng)相的脫氣,流動(dòng)相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小

62、保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化,流動(dòng)相脫氣的方法,加熱簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,樣品的預(yù)處理

63、,樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于色譜柱及儀器的保護(hù),樣品的預(yù)處理重要性,占樣品分析時(shí)間的比例樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟,樣品預(yù)處理常用的方法,高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取 / 液-液萃取 S

64、ep-Pak樣品處理小柱其他,樣品預(yù)處理的過程,去除微粒,過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5m)/無機(jī)(0.45m)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡(jiǎn)單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g,超濾,機(jī)理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白有

65、機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，過氯酸鹽50% 硫酸銨10% TCA,樣品衍生,提高檢測(cè)的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測(cè)的靈敏度增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測(cè)器改變分離的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子氨基酸分析,樣品衍生∶氨基酸分析,AccQ-Tag 衍生法,濃縮樣品,濃縮樣品的方法 萃取/吹干 沉淀/再溶解 色譜法 液固抽提/Sep-Pak小柱,固相

66、萃?。⊿PE）技術(shù),固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性實(shí)驗(yàn)室中60~80%的成本及工作量在樣品制備上加速樣品的制備時(shí)間降低樣品前處理的成本提高分析的準(zhǔn)確性及回收率更容易自動(dòng)化減少樣品處理步驟降低對(duì)不穩(wěn)定樣品的影響提高安全性,Waters的Sep-Pak小柱,Waters專門開發(fā)了固相萃取技術(shù)（SPE）Sep-Pak小柱的應(yīng)用領(lǐng)域除去雜質(zhì)及干擾組份

67、把樣品分成不同極性的組分析富集微量的組份Sep-Pak小柱的主要種類反相正相離子交換,Sep-Pak的種類,根據(jù)Sep-Pak及樣品的性質(zhì)，選洗脫強(qiáng)度不同的溶劑把樣品分開讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用 讓所感興趣的樣品通過小柱，雜質(zhì)留在柱上 讓雜質(zhì)留在柱上，所感興趣的樣品通過小柱,各種Sep-Pek小柱（一）,正相包括∶Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN /

68、Alumina可先用6到10倍柱體積的非極性（通常是樣品溶液）平衡加入樣品用非極性溶劑洗脫不想要的組份用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更強(qiáng)的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如∶NH2 / CN確認(rèn)回收率,各種Sep-Pek小柱（二）,反相包括∶C18 / tC18 / C8 / tC2 / Diol / NH2 / CN可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍

69、柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了樣品溶解在強(qiáng)一些極性的溶劑中加入樣品用強(qiáng)極性溶劑洗脫不想要的組份用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份確認(rèn)回收率,各種Sep-Pek小柱(三),離子交換包括∶Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液平衡，樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中加入樣品用弱緩沖液洗脫不想要