微生物次級代謝

1、,4 微生物次級代謝與調節(jié),4.1 引論,初級代謝與次級代謝定義： 初級代謝：為生物提供能量、合成中間體及其關鍵大分子，如蛋白質、核酸等的各種相互關聯(lián)的代謝網絡(包括分解與合成)。 次級代謝：主要涉及合成過程，其終產物、次級代謝物對菌生長不是必需的，對其生命活動可能具有某種意義，通常在生長后期開始形成。,次級代謝產物(Secondary Metabolites)是某些微生物在生命循環(huán)的某一個階段產生的物質，它們一般是在產生菌生長中止

2、后合成的。,微生物產生的次級代謝物有：抗生素: 青霉素、萬古霉素、紅霉素色素: 放線紫紅素(Act)、Red生物堿(alkaloid): 嗎啡、喜樹堿毒素,研究微生物次級代謝的意義：,獲得與次級代謝有關的基礎理論知識，并用于設計更為有效的途徑來合成這類復雜的化合物或改造它們，以獲得所需的生物性質；有助于優(yōu)化次級代謝產物的工業(yè)生產。借助于生物合成途徑的知識，利用基因工程技術可以幫助構建在遺傳學上能產生新化合物的突變株。,①一般

3、不在生長期產生，而在生長后期形成,（一）微生物次級代謝的特性,抗生素晚合成的原因之一可能是避免生長受其自身產物的抑制； 次級代謝產物的合成過程一般是在培養(yǎng)基中缺乏某種營養(yǎng)物質，菌體生長受到限制時才啟動的。,,,②種類繁多，結構特殊，含不常見的化學鍵：,氨基糖、苯醌、香豆素、環(huán)氧化合物、麥角生物堿、戊二酰胺、多烯、吡咯、喹啉、萜烯、四環(huán)類抗生素等； β-內酰胺環(huán)、聚乙烯和多烯的不飽和鍵、大環(huán)內酯的大環(huán)和含有普通AA和經修飾的AA

4、組成的環(huán)肽等；,③一種菌所合成的次級代謝物往往是一簇結構相似的化合物。,舉例： 產黃青霉能產生10種具有相同母核、不同側鏈的天然抗生素，結構上的差別使它們具有不同的生物活性。(參閱表4-1/P159)一簇抗生素中組分的比例取決于遺傳和環(huán)境因素，這是由于參與次級代謝物合成的酶的專一性不強所致；而初級代謝方面的特異性總是很高，因差錯會導致致命性的后果。次級代謝方面的差錯對細胞的生長無關緊要，改變后的代謝產物有些還保留生物活

5、性。,④一種微生物的不同菌株可以產生分子結構迥異的次級代謝物。 例如：灰色鏈霉菌可生產鏈霉素、白霉素、吲哚霉素、灰霉素、灰綠霉素和灰爭霉素等；,不同種類的微生物亦能產生同一種次級代謝物。 例如：如產黃青霉、點青霉、土曲霉、構巢曲霉、發(fā)癬霉屬的一些真菌都能產生青霉素；,⑤微生物由生長期向生產期過渡時，菌體在形態(tài)學上會發(fā)生一些變化。例如，一些產芽胞的細菌在此時會形成芽胞，真菌和放線菌會形成孢子。因此，有人把次級代謝產物

6、的合成作用看作是細胞分化的伴隨現(xiàn)象。,⑥次級代謝產物的合成比生長對環(huán)境因素更敏感。其合成信息的表達受環(huán)境因素調節(jié)。,例如：菌體生長可在0.3～300 mmol/L磷酸鹽濃度下進行，而次級代謝物合成的最適濃度為0.1～10mmol/L。,⑦次級代謝產物的合成是由多基因控制的代謝過程。,這些基因不僅位于微生物的染色體中，也位于質粒中，并且染色體外的基因在次級代謝產物的合成中往往起主導作用。,（二）次級代謝物的生物合成,生源學(biogene

7、sis)指的是代謝產物分子中構建單位的各種原子的起源； （有機化學）生源學又稱為生物發(fā)生學，是指一些天然物質（包括有生命的物質）為什么會發(fā)生、存在的原因，及它對宿主，環(huán)境有何作用的科學。 （生物化學）生物合成指的是各構建單位在多種酶的作用下合成次級代 謝產物的過程。（生物化學）,次級代謝物生物合成步驟： ① 養(yǎng)分攝入細胞內； ② 通過中樞代謝途徑養(yǎng)分轉化為中間體； ③ 次級代謝物前體的生物合成； 中間體 ：對初

8、級代謝而言； 前體： 對次級代謝而言；有時二者是同一物質，有時前體在中間體的基礎上結構略有改變。 ④ 如有必要，改變其中的一些中間體； ⑤ 前體進入次級代謝物生物合成的專有途徑； ⑥ 次級代謝的主要骨架形成后，作最后的修飾，成為產物。,次級代謝物通常由初級代謝中間體產生,①氧化還原反應：一般涉及醇的氧化或羰基的還原，雙鍵的引入或還原，氧原子的引入和芳香環(huán)的氧化裂解，這些反應是由脫氫酶或加氧酶催化的。 ②生

9、物甲基化是各種代謝物，特別是聚酮化物的生物合成中的重要反應。甲基的主要來源為甲硫氨酸、高半胱氨酸、甘氨酸和絲氨酸。 ③鹵化作用對分子中含鹵元素(大多數(shù)是氯)的次級代謝物是很重要的。,將初級代謝中間體轉化為次級代謝終產物有三個生化過程：,抗生素的生源學,抗生素生源學研究一些微生物會產生這類對其它微生物、甚至對其自身有害物質的原因及這類物質的功能。在這方面的了解將有助于解釋抗生素的形成機制和控制其生產。,抗生素的生源學(B

10、iogenesis),1)合成次級代謝物是作為儲藏物。2)作為正常代謝的無用的副產物。3)大分子消化后殘留的碎片。4)解除體內有害代謝物的毒性。5)支路代謝物。6)競爭需要，用于抑制其它微生物，爭奪有限的養(yǎng)分。,抗生素的生源學(Biogenesis),7)進化遺留所致。8)在自然界具有生態(tài)上功能。9)調節(jié)功能，至少與形態(tài)學，分化方面有關。10) 代謝維持產物，其作用主是代謝過程，而不是產物本身。,可根據(jù)次級代謝產物分子中

11、的主要組分與初級代謝的關系，把次級代謝產物分成五個基本類型：,（二）次級代謝物的類型,次級代謝產物的類型,糖類 許多次級代謝產物在結構上明顯與糖類物質有關。它們的前體物質都是葡萄糖，但是它們的結構在次級代謝過程中被修飾了。例如，鏈霉素，新霉素和卡那霉素等均是分子結構被修飾了的寡糖類抗生素。,次級代謝產物的類型,多肽類 同糖類物質一樣，氨基酸或其聚合物(多肽)在次級代謝過程中常常被修飾，形成多肽類抗生素。例如鏈霉菌產生的放線菌素是

12、由寡肽構成的。還包括芳香族氨基酸或其他氨基酸合成途徑的中間體產物被修飾后形成的抗生素。例如，委內瑞拉鏈霉菌產生的氯霉素和頭狀鏈霉菌產生的絲裂霉素C等。,次級代謝產物的類型,聚脂酰類 這類化合物均以活性脂酰作為前體，通過聚合作用形成的。由乙酰輔酶A可以形成兩類自身縮合產物：一類是通過頭尾聯(lián)接的聚乙酮(酰)化合物；另一類是通過新形成的活性異戊二烯的寡聚作用形成的化合物。這類化合物可形成萜類、甾類和類胡蘿卜素類次級代謝產物。屬于這類次級產

13、物的有水稻惡苗病菌產生的赤霉素等。,次級代謝產物的類型,核酸堿基類似物類 此類次級代謝產物的合成明顯地與核酸堿基的合成相關。它們或者由細胞中現(xiàn)成的核苷酸經化學修飾轉變而來，或者通過與核苷酸生物合成相似的過程合成而來。例如6-氨基嘌呤，焦土霉素，狹霉素，蛹螬菌素等。,次級代謝產物的類型,其它類型 微生物還產生一些不屬于上述四種類型的次級代謝產物。因為人們很難根據(jù)這類化合物分子中的組分的來源，把它們歸于上述任何一種類型的次級代謝產物

14、。,4.2 次級代謝物生物合成的前體,1、前體的定義,（一）前體的概況和來源,前體現(xiàn)代定義： 指加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，它能被微生物直接結合到產物分子中去，而自身的結構無多大變化，且具有促進產物合成的作用。,中間體： 指養(yǎng)分或基質進入一途徑后被轉化為一種或多種不同的物質，它們均被進一步代謝，最終獲得該途徑的終產物。,前體與中間體的區(qū)別： 前體的結構往往略需改變后才進入到代謝途徑中去；有時指同一物質。有些中

15、間體可直接用作前體。但有些需經修飾才能作為前體。,次級代謝物前體的種類：,Betina認為，次級代謝物的前體大多數(shù)源自初級代謝的中間體：,①糖類；②莽草酸和(或)芳香AA；③非芳香AA；④C1化合物；⑤脂肪酸(尤其是乙酸和丙酸)；⑥TCA循環(huán)的中間體；⑦嘌呤和嘧啶。,Martin等將可作為次級代謝物前體的初級代謝的中間體分為：,①短鏈脂肪酸；②異戊二烯單位；③AA；④糖與氨基糖；⑤環(huán)己醇與氨基環(huán)己醇；⑥脒基；⑦嘌

16、呤與嘧啶堿；⑧芳香中間體與芳香AA；⑨甲基(C1庫)。,次級代謝物的生物合成過程，除了在前體的形成和聚合過程外，遵循一般的生物合成規(guī)律。 次級代謝途徑同初級代謝的分解代謝、無定向代謝和組成代謝緊密相關。其前體通常是正常的或經修飾的初級代謝的中間體。,小結：,乙酸、丙酸、丙二酸、甲基丙二酸，形成乙酰 CoA、丙二酰 CoA、甲基丙二酰 CoA 等前體，作為抗生素建筑材料進入次級代謝途徑。,乙酰CoA與幾個分子丙二酰Co

17、A或甲基丙二酰CoA線性縮 合生成聚酮（polyketide）代謝物。如：四環(huán)素簇，大環(huán) 內酯和多烯大環(huán)內酯環(huán)骨架。,2、前體的來源由初級代謝物衍生次級代謝物的途徑,（1）短鏈脂肪酸途徑,（2）芳香中間體,莽草酸途徑的中間體或終產物：莽草酸，對氨基苯甲酸，色氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸，形成許多次級代謝物的芳香部分 。莽草酸途徑負責大多數(shù)放線菌和許多植物次生代謝物的生物合成；而大多數(shù)真菌產生的芳香代謝物是由乙酸通過聚酮（

18、polyketide）途徑合成。,,舉例： ①氯胺苯醇和棒桿菌素的生色團是由分枝酸衍生的。 ②利福霉素的芳香成分來自莽草酸。 ③綠膿菌素的吩嗪骨架源自鄰氨基苯甲酸。 ④新生霉素和黃青霉素的芳香部分來自酪氨酸。 ⑤放線菌素、吲哚霉素、硝吡咯菌素的芳香環(huán)源自色氨酸。,（3）經修飾的糖前體,①氨基糖苷類抗生素： 其糖大多數(shù)來自葡萄糖，其碳架以整體方式結合到抗生素中。但往往需要經過修飾或轉化。

19、 糖的修飾：差向異構化，異構化，氨化，去羥基，重排(生成分枝糖)，脫羧，氧化和還原。 糖的轉化：以核苷二磷酸衍生物，如UDP-葡萄糖形式進行。UDP-葡萄糖由葡萄糖-1-P的葡萄糖基轉給UTP獲得。但是，大環(huán)內酯類抗生素的糖的生物合成是以TDP-衍生物作為中間體形式進行的。己糖胺的形成是通過己酮糖和谷氨酰胺的轉氨作用完成的。,（4）異戊二烯單位異戊二烯單位是甾體化合物和萜類的形成單位。,（5）甲基的來源

20、 抗生素生物合成中的所有甲基化作用均以甲硫氨酸（Met）作為甲基供體，通過甲基轉移酶進行。 而Met的甲基源自N5-四氫葉酸。 轉甲基時Met先活化，即在Mg2+和ATP存在下生成高能甲基供體：S-腺苷酰甲硫氨酸(SAM)。以SAM進行甲基化后自己變成S-腺苷酰高半胱氨酸(SAH)，后者可被水解為腺苷和高半胱氨酸。,形式：N-甲基化；O-甲基化,（1）抗生素建筑材料,（二）前體的作用,例如：

21、 丙酮酸可用于Ala、Val、Leu等的合成，是幾種肽類抗生素（頭孢菌素簇或青霉素簇）合成的重要中間體。,許多次級代謝物是用不同的中間體作為建筑單位合成的。,例如：大環(huán)內酯類抗生素：其糖苷配基是由脂肪酸衍生的，其糖部分是由葡萄糖衍生的。真菌毒素和橘霉素：是由五個C2單位(Ac-CoA加上4個丙二酰CoA)，2個甲基和由C1庫來的羧基合成的。新生霉素：具有更為復雜的來源，它是由葡萄糖、莽草酸、GLN、C1庫、Tyr和乙酸或L

22、eu合成的。,（2）誘導抗生素生物合成 前體具有調節(jié)抗生素生產的作用，尤其在細胞中的特殊合成酶的活性已被激活的情況下。,例1： 在棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)中頭霉素C的一種前體，α-氨基己二酸是由賴氨酸合成途徑來的。它與蛋白質合成競爭此前體的供應。加入過量的Lys， Lys途徑中間體，二氨基庚二酸或α-氨基己二酸到發(fā)酵液中可增加頭霉素的發(fā)酵單位。,例2：

23、 產黃青霉的青霉素酰基轉移酶可轉化異青霉素N，除去青霉素N的側鏈，換上天然青霉素的其他側鏈。側鏈的置換取決于發(fā)酵液中含有適當?shù)那绑w，如苯乙酸或苯氧乙酸等。故芐青霉素的發(fā)酵單位隨發(fā)酵液中的限制性苯乙酸的增加而提高。,例3： L-Val被認為是環(huán)孢菌素A的前體和生物合成的誘導物。加入Val可促進T. inflatum固定化細胞合成環(huán)孢菌素A。例4： 赤霉素受葡萄糖的阻遏。這可通過加入3-甲基-3,5-二羥

24、基戊酸克服。,例5： 丙醇和丙酸具有促進紅霉素生產的作用，丙酸的作用稍差些。在發(fā)酵前期加入丙醇會干擾生長，從而降低抗生素的合成。先前認為，丙醇的促進作用完全是由于起前體的作用，現(xiàn)已清楚，除了作為前體外，它還能誘導紅霉素鏈霉菌的Ac-CoA羧化酶。此誘導作用似乎發(fā)生在轉錄水平，因在發(fā)酵中加入放線菌素D可以阻抑這種作用。,（3）前體與誘導物的區(qū)別,誘導作用在次級代謝物的合成控制上起重要作用。有時難于區(qū)分這種促進作用是真的誘導

25、物的作用還是前體的作用。,①誘導物與前體的作用時期不同。 一般把那些能在生長期內，生產期前促進抗生素生物合成的化合物看做誘導物，而前體往往只在生產期內起作用，甚至蛋白質合成受阻的情況下也行。,②誘導物應能被非前體的結構類似物取代。 如Met除了可作為頭孢菌素合成的前體，提供S的作用，更為重要的作用在于誘導節(jié)孢子的形成，而后者的多寡影響頭孢菌素的合成。 Met可被Leu取代。 ③誘導物的另一個特征是其誘導

26、系數(shù)特別高。 如誘導鏈霉素形成的A因子，給鏈霉素生物合成受阻的突變株1?g 純的A因子(在接種時)，可誘導1g鏈霉素的形成，其誘導系數(shù)為106。,（三）前體的限制性,前體常常是次級代謝物生物合成的限制因素。例1：在發(fā)酵過程中加適量苯乙酸可強烈促進芐青霉素的生產；例2：丙酸或丙醇促進大環(huán)內酯抗生素的生物合成。例3：肽類抗生素的形成中非蛋白的AA成分通常是限制因素。如粘菌素的生物合成受?-氨基丁酸和?,?-二氨基丁酸的限制；桿菌

27、肽的生產受鳥氨酸的限制。,例4：乙酰CoA (Ac-CoA)缺少會限制四環(huán)素的生產。金色鏈霉菌低產菌株的特征是Ac-CoA傾向于走TCA循環(huán)而被氧化；高產菌株沒有這一傾向。(表現(xiàn)為ATP水平高)例5：諾爾斯鏈霉菌(Streptomyces noursei var polifungini)合成制霉菌素的能力的提高與其前體，丙二酸和甲基丙二酸合成的增加有關。,（3）添加前體的策略,外源前體在發(fā)酵液中的殘留濃度過高，會使生產菌中毒，不利于

28、抗生素的合成。但前體不足也不行。研究前體添加策略對有些抗生素高產穩(wěn)產有重要意義。,舉例：青霉素G生產需要加入苯乙酸或苯乙胺，發(fā)酵培養(yǎng)基中常用玉米漿的原因之一是這種原料含有苯乙胺。苯乙酸具有促進青霉素生物合成的作用，可在基礎料中和過程中添加，其理論用量為0.47g苯乙酸/g青霉素G；0.50g苯乙酸/g青霉素V。實際用量應考慮利用率。高產菌株對前體的利用率(可>90％)比低產菌株高許多。 添加前體時宜少量多次或流加，控制發(fā)酵液中

29、前體的殘留濃度在適當范圍。例如：苯乙胺濃度在0.05％～0.08％。,4.3 次級代謝物的生物合成原理,(1) 把前體引入次級代謝物生物合成的專用途徑,前體一旦合成，便流向次級代謝物生物合成的專用途徑。前體聚合作用是次級代謝特有的、普遍的合成機制。通過前體聚合作用的次級代謝物有四環(huán)類、大環(huán)內酯類、 安莎霉素類、真菌芳香化合物的聚酮類和肽類、聚醚和聚異戊二烯類抗生素。這些特有的生物合成中間產物需作后幾步的結構修飾，修飾的深度取決于產

30、生菌的生理條件。有些復雜抗生素是由來自不同生物合成途徑的幾個部分組成的。,了解這方面所涉及的生物合成酶很重要，尤其是專用途徑的第一個酶，因它決定了前體進入次級代謝物合成途徑的通量、中間體的流向和途徑的生產能力。,途徑的其他關鍵酶也可能是控制步驟，這類酶常受碳、氮分解代謝物的阻遏以及磷和反饋調節(jié)。其中有些酶可能受胞內積累的高濃度前體的誘導。,次級代謝專用的關鍵酶通常受次級代謝物的控制：例1：麥角生物堿生物合成的第一個酶受Trp或其類似

31、物的誘導作用。從生長期到生產期的過渡期間較高的Trp庫存量導致DMAT合成酶的濃度增加。例2：苯惡嗪酮合成酶是放線菌素生物合成的關鍵酶，受葡萄糖分解代謝物阻遏。例3：磷酸阻遏灰色鏈霉菌的對氨基苯甲酸合成酶的形成。,通過前體單體聚合的次級代謝物有： 四環(huán)類、大環(huán)內酯類、安莎霉素(ansamycin)類、真菌芳香化合物的聚多酮類和肽類(包括同型、雜型和縮酚肽)抗生素，以及聚醚和聚異戊二烯類抗生素。 這些聚合過程所涉及的生

32、物合成機制對上述次級代謝物均適用。這說明這類合成酶具有共同的進化淵源。,(2) 前體聚合作用過程,,聚合反應是由高相對分子質量的合成酶催化的：,例如：肽類抗生素合成酶 (NRPS, non-ribosomal peptide synthases) 聚多酮合成酶 (PKS, polyketide synthases),聚合后許多次級代謝物的化學結構通過多步酶反應修飾

33、完成。,(3) 次級代謝物結構的后幾步修飾,例1： 在四環(huán)類抗生素生物合成中聚合的九酮化物中間體通過閉環(huán)轉化為6-甲基四環(huán)化物，后者經幾步轉換，包括C-4的氧化，C-7的氯化(金霉素合成的情況下)，C-4的氨化，隨后在氨基上的甲基化。,例2： 紅霉素生物合成的最后幾步(即紅霉內酯形成后)為連接兩個脫氧糖，和這些糖的O-甲基，N-甲基或C-甲基化。,例3： 頭孢菌素生物合成的最后幾步為去乙酰氧頭孢菌素C(經閉環(huán)和

34、擴環(huán)步驟產物)被羥基化為去乙酰頭孢菌素C，后通過乙酰CoA(去乙酰頭孢菌素C?；D移酶以乙酰CoA作用乙?；o體)轉化為頭孢菌素C 。,某些次級代謝物是由單一類前體衍生的，例如，同型肽。 許多次級代謝物由幾類不同的前體合成的。例如，雜肽類抗生素是由氨基酸和脂肪酸組裝成的。,(4) 復合抗生素中不同部分的裝配,例1：在縮酚(depsi)肽抗生素中AA與羥酸連接。 例如，纈氨霉素含有乳酸和D-羥異戊酸(圖4-7)。,圖4-

35、7 纈氨霉素分子的排列,例2：鏈霉素、諾卡菌素A、殺假絲菌素和新生霉素是由幾種不同前體組裝的典型抗生素。,,④諾卡菌素：由L-高絲氨酸、修飾過的L-對羥苯甘氨酸、L-Ser和未經修飾的L-對羥苯甘氨酸組成 。,次級代謝物合成酶往往只具有簇的專一性，即對基質分子的某一部分有要求，對分子的其他部分無絕對要求。,(5) 次級代謝物合成酶的專一性,例如：產黃青霉的青霉素?；D移酶能催化青霉素N的a-氨基己二酰側鏈，使轉化為疏水性的?；鶄孺?。此反

36、應的專一性較高，因它不能?；?-氨基頭孢霉烷酸(7-ACA)，但接受廣泛的內源與外源?；鵆oA衍生物。,參與初級代謝物和次級代謝物生物合成的基本差別之一在于引物和延長單位的異質性。 例如：如由于缺少高度專一性，乙酰CoA、丙二酰CoA和丙二酰胺CoA可在四環(huán)類抗生素合成中作引物。 大環(huán)內酯生物合成中的延長單位有丙二酸、甲基丙二酸和丁酸。,然而，不是所有參與次級代謝物合成的酶都缺乏基質專一性。有些具有高度專一

37、性。 例1：紅霉素合成酶形成紅霉內酯糖苷配基時只接受甲基丙二酰CoA作為延長單位，而不用丙二酰CoA單位。殺假絲菌素合成酶總是按既定的順序聚合適當?shù)那绑w單位。,通過基因操縱可以改變次級代謝物合成酶的專一性。其突變株常能形成特殊的次級代謝物，形成新的終產物。,4.4 抗生素的生物合成,天然產物類別,天然產物,萜類,生物堿,輔酶因子,非核糖體多肽,脂肪酸衍生物與聚酮,,,,,,聚酮和非核糖體肽化合物是復雜天然產物中的兩大家族，

38、分別由簡單的羧酸和氨基酸單體構成，具有重要的醫(yī)藥和農用化學品的特性，其生物分子的結構極其復雜多樣。雖然兩者利用的底物不同，但他們的生物合成均是在一個大的多功能蛋白的控制下完成的，前者命名為PKS，后者命名為NRPS。兩種復合酶均包含線性、連續(xù)重復的活性區(qū)域稱之為模塊，每個模塊可催化多聚酮或多肽連的一輪延伸并進行適當?shù)男揎?，最后解鏈得到相應的產物。,非核糖體多肽合成酶(NRPS, non-ribosomal peptide syntha

39、ses)聚酮合成酶 (PKS, polyketide synthases),一、聚酮體生物合成途徑,基于商業(yè)性的原因，迄今為止，一些具有聚酮體生物合成（polyketide synthases，PKSs）途徑的“天然產物”，如紅霉素、阿維菌素、泰樂菌素、柔紅霉素、阿克拉霉素、西羅莫司和利福霉素等；,具PKS途徑的抗生素,由7個丙酸單位按照與脂肪酸合成過程相似的機制形成: 以丙酰CoA為引物，依次以甲基丙二酰 CoA 作為延伸

40、單 位接上6個丙酸單位。,前體：活化丙酸單位；,大環(huán)內酯類：紅霉素,結構：一大環(huán)內酯和兩種糖，脫氧氨基己糖和紅霉糖；,紅霉素的生物合成途徑,紅霉素產生菌的生物合成,參與紅霉素生物合成的PKSs，或6－脫氧紅霉內酯合成酶（6-deoxyerythronolide B synthase，DEBS）有6個模塊組成，每個模塊負責合成聚酮體中的一部分。由于各模塊之間的協(xié)調性，以及每個模塊編碼決定延伸單位的選擇、功能和立

41、體化學性質的催化結構域，因此，就有可能通過對PKSs結構域或模塊的操作獲得具有新穎結構的化合物。PKSs基因簇的大小在10～100 kb左右不等。,PKS中的每一個模塊的組成,酮基合成酶（ketosynthase，KS）酰基轉移酶（acyl transferase，AT）?；d體蛋白（acyl carrier protein，ACP）這些域對于聚酮鏈的二碳單元的得加長是必需的。β-酮基修飾酶：包括酮基還原酶（ketoredu

42、ctase，KR）、脫氫酶（dehydrogenase，DH）和烯酰還原酶（enoylreductase，ER）大多數(shù)典型的聚酮體合成途徑的產物包括對PKS產物的修飾，如將脫氧糖或氨基糖進行糖苷化以及通過細胞色素P450進行氧化。圖中所示的LD為裝載域（loading domains），TE為釋放域，即硫酯酶（esterases）。,C,Monocistronic：單順反子，一個啟動子后僅具有一個編碼序列。Polycistroni

43、c：多順反子，若干個基因由一個啟動子控制，轉錄在一條mRNA上。,Organization of natamycin gene cluster,a tetraene macrolide antibiotic produced by S.natalensis,轉錄因子,原核生物轉錄,轉錄因子對靶基因啟動子區(qū)域DNA序列的識別與結合是整個調控的核心。發(fā)現(xiàn)次級代謝途徑特異性轉錄調控因子，深入研究其轉錄調控機理，是微生物生理與代謝、生化與

44、遺傳的核心關鍵問題之一。,納他霉素,納他霉素（natamycin），也稱游鏈霉素或匹馬霉素（pimaricin）是由納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis）產生的一組多烯大環(huán)內酯類抗生素，其化學結構如圖。恰塔努加鏈霉菌（Streptomyces chattanovgensis）和褐黃孢鏈霉菌（Streptomyces gilvosporeus）也能夠產生該類混合物。,納他霉素,納他霉素能夠專一性地抑制酵母和霉菌，阻

45、止絲狀真菌中黃曲霉毒素的形成。與其他抗真菌物質相比，納他霉素對哺乳動物細胞的毒性極低，可以廣泛用于由真菌引起的疾病。除此之外，由于納他霉素的溶解度低，可用其對食品表面的處理以增加食品的保質期，卻不影響食品的風味和口感。因此，40多年來食品行業(yè)對它的興趣不減。納他霉素作為一種天然的食品防腐劑已被批準用于某些乳制品、肉類、水果和飲料等許多食品工業(yè)中。目前，已成為世界30多個國家廣泛使用的一種天然食品防腐劑和抗菌添加劑，美國FDA于1982年

46、批準納他霉素可作為食品防腐劑，我國于1997批準作為食品防腐劑。,納他霉素,納他霉素之所以被廣泛用于食品工業(yè)，主要是具有四個特點：1）劑量低，效率高，抑菌作用比山梨酸強50倍左右；2）適用pH范圍廣，而一般適用的山梨酸的防腐效果隨pH的升高而降低；3）無特殊感官形狀；4）抑制有害真菌而不影響有益菌群。,二、非核糖體多肽生物合成途徑,非核糖體生物合成（non-ribosomal peptide synthases，NRPS）途徑的

47、“天然產物”，如青霉素、頭孢菌素、多粘菌素、放線菌素、納塔霉素和短桿菌肽S等；,不用蛋白質合成所用的轉錄–翻譯機構，故無需核糖體、tRNA和mRNA,.,青霉素的合成機制青霉素、頭孢霉素C合成的前體物質有半胱氨酸（cys)、纈氨酸(val)、α-氨基己二酸及苯乙酸等。 3個前體氨基酸由葡萄糖轉化而成，首先，在三肽合成酶（ACVS ）的作用下，將它們縮合成三肽（LLD-ACV），然后，由異青霉素N合成酶（IPNS）催化LLD-ACV

48、氧化閉環(huán)（環(huán)化），生成異青霉素N（IPN），再與活化的側鏈前體苯乙酰CoA或苯氧乙酰CoA將IPN轉化成青霉素G或青霉素V（轉酰基）。,,,,① L-α-氨基己二酸,② L- 半胱氨酸,③ L-纈氨酸,青霉素生物合成前體,,,,,,（LLD—ACV）,（異青霉素N）,（青霉素G）,三肽合成酶,異青霉素N合成酶,異青霉素N?；D移酶 ?；o酶A 、苯乙酸,,青霉素的生物合成途徑,NRPS中的每一

49、個模塊的組成,腺苷?；?adenylation, A)縮合(condensation, C)肽基結合蛋白(peptidyl carrier protein, PCP)，又稱硫化域(thiolation, T)這些域共同作用于氨基酸使其添加到延伸的寡肽上。3個修飾結構域：差向異構化結構域(Epimerization, E)， N-甲基化結構域(N-methylation, M)、氧化結構域(Oxidation)。 PKS中模

50、塊的順序決定了編碼的結構，模塊的數(shù)量決定加入的二碳單元的數(shù)量(或模塊的鏈長度)。NRPS與PKSs基因簇相似，其模塊的順序、特性和數(shù)量分別決定了氨基酸寡肽的性質和長短。,Chloroeremomycin（氯伊瑞霉素，萬古霉素類似物）生物合成,乳鏈球菌素,乳鏈球菌素（nisin）也稱乳鏈菌肽，是某些乳酸鏈球菌產生的一種多肽化合物，由34個氨基酸組成，其化學結構如圖23－16所示。乳鏈球菌素在英國已經有近50年的使用歷史，全世界有50多個國

51、家正在使用。,乳鏈球菌素的化學結構,乳鏈球菌素,乳鏈球菌素能有效地抑制引起食品腐敗的許多革蘭陽性菌（如肉毒梭菌、金黃色葡萄球菌、溶血鏈球菌和利斯特菌）的生長和繁殖，尤其對產生孢子的革蘭陽性菌（如枯草芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌）等有很強的抑制作用。廣泛被用于乳制品、罐裝食品、植物蛋白食品，以及肉制品的防腐和保鮮。在添加乳鏈球菌素的食品中，可以降低滅菌溫度和縮短滅菌時間，以及改善食品的品質和降低能耗。我國于1990年批準用于食品添加劑。,萬

52、古霉素的生物合成,另據(jù)研究，天然的萬古霉素生物合成共有35步，其先以五種自由的氨基酸單體合成一線形的七肽，然后芳基邊鏈在交聯(lián)酶的催化下適時地組合、交聯(lián)，形成復雜的七肽骨架，最后UDP-glucose和UDP-4-epi-vancosamine在糖基轉移酶的作用下連接到七肽骨架上。,萬古霉素生物合成的五種起始自由氨基酸單體,萬古霉素生物合成的逆向合成分析圖,以經修飾的糖為前體的抗生素—鏈霉素的合成為例,分子中帶有經修飾的糖的抗生素主要有：

53、氨基糖苷類、大環(huán)內酯類和蒽環(huán)類抗生素。鏈霉素屬于氨基糖苷類抗生素。生產菌—灰色鏈霉菌,鏈霉素的合成,鏈霉素由N-甲基-L葡萄糖胺、鏈霉糖和鏈霉胍三個部分組成。此三種糖均由葡萄糖衍生而來。轉脒基酶和鏈霉胍激酶是參與鏈霉素合成的兩個關鍵酶。開始合成的時間—生產期。鏈霉素分子的連接：dTDP-雙氫鏈霉糖與鏈霉胍-6-P形成擬二糖，擬二糖再與N-甲基-L葡萄糖胺合成雙氫鏈霉素-6-P，再經兩步氧化、水解生成鏈霉素。,鏈霉素生物合成的假設

54、途徑,調節(jié),碳源的調節(jié)cAMP的調節(jié)作用磷酸鹽的調節(jié)作用A因子,什么是A因子：,2-S-異辛?；?3-R-羥甲基-γ-丁酸內酯是鏈霉菌產生的一種生理代謝自調節(jié)物質—γ-丁酮內酯的一種。 γ-丁酮內酯具有調節(jié)次級代謝物與氣生菌絲與孢子形成的作用，類似真核生物的激素。已分離出11種γ-丁酮內酯自調節(jié)物質。A因子能促進鏈霉素的合成，所有生產用菌株都能產生A因子。A因子參與菌絲的分化作用，孢子形成及菌株對自身鏈霉素的抗性與此有關。,T

55、he A-factor regulatory cascade of Streptomyces griseus,作用機制：是一種級聯(lián)調控方式。,生長期，A因子水平低，與其受體蛋白ArpA結合，但不能使其從啟動子處解離，關鍵基因adpA處于關閉狀態(tài)。AdpA編碼一種次級代謝物或氣生菌絲形成的必需的轉錄聚合物。隨A因子濃度增加到一定值，ArpA從DNA上解離，adpA的轉錄啟動。受adpA基因產物的激活，專一性鏈霉素合成基因strR被表達

56、，其基因產物繼續(xù)激活鏈霉素合成的所有基因的轉錄。,根據(jù)微生物藥物的生物合成原理發(fā)現(xiàn)微生物新藥的方法和途徑,通過非基因定向改變、基因定向改變，以及組合生物催化的技術，或是改變原有微生物藥物的生物合成途徑，或是對原有的微生物藥物（或先導化合物和中間體）進行生物催化，以發(fā)現(xiàn)微生物新藥。,已有的研究表明，在抗生素等次級代謝產物生物合成中酶－底物的特異性足以使結構相關的代謝產物在其發(fā)酵液中積累；但由于生物合成酶的底物專一性較低（寬泛性），其野

57、生型菌株或阻斷突變株的發(fā)酵過程中添加一些已知結構類似物作為前體物質，可以產生含有與這種已知結構類似的新衍生物；這種獲得新次級代謝產物的途徑，可以被稱之為非遺傳操作的定向生物合成 (directed biosynthesis)。,定向生物合成,應用實例,應用非遺傳操作定向生物合成的方法能夠制備獲得許多新的抗生素，其中目前已進行工業(yè)化生產的有：青霉素G和V；培羅霉素；四環(huán)素和金霉素等。,.,青霉素和6－APA分子結構及各種天然青霉素

58、的結構與名稱,,青霉素分子的化學結構,6－APA的化學結構,各種天然青霉素具有的側鏈和名稱,四環(huán)類抗生素的定向生物合成,微生物發(fā)酵產生的一些四環(huán)素類抗生素,四環(huán)類抗生素的定向生物合成,在生產金霉素時需添加氯化物作為前體，而當生產四環(huán)素時，則必須要在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加氯離子抑制劑，如溴化物或M-促進劑等，從而抑制金霉素的合成而得到四環(huán)素產物。 另外，用金色鏈霉菌在發(fā)酵的金霉素過程中添加適量的甲基化反應抑制劑如磺胺嘧啶鈉，能夠獲得去甲基

59、金霉素。,突變生物合成,突變生物合成（mutational biosynthesis）是指野生型產生菌經化學或物理等因素誘變處理后，喪失合成原來次級代謝產物的能力而成為阻斷突變株，然后在發(fā)酵培養(yǎng)阻斷突變株時添加某種外源物質，參與生物合成以獲得新的次級代謝產物的過程。另外，突變生物合成也包括由于突變而引起產生新的次級代謝產物。,突變生物合成與微生物新藥發(fā)現(xiàn),.,突變生物合成原理 ——阻斷突變株的類型,營養(yǎng)缺

60、陷型突變株(auxotroph)： 由于編碼菌體生長之必須的酶的基因發(fā)生了突變，而使菌體不能生長，導致不能合成次級代謝產物。因此，這類突變株也可以稱為初級代謝阻斷突變株。獨需型突變株(idiotroph)： 這種突變株的生長和初級代謝正常，但由于編碼次級代謝產物合成的某一基因發(fā)生突變，而使喪失了合成次級代謝產物的能力。這是突變生物合成所需要的突變株。雙重阻斷突變株： 即突變既發(fā)生在編碼初級代謝酶的基因上，也發(fā)生在編碼次級

61、代謝酶的基因上。,紅霉素生物合成途徑,.,突變生物合成產生的新抗生素,.,4.5 微生物次級代謝的調控,The regulation of antibiotic production is complex (P205),次級代謝產物的誘導調節(jié)次級代謝產物碳源分解調節(jié)次級代謝產物氮源分解調節(jié)磷酸鹽調節(jié)抗生素生物合成啟動的控制抗生素生物合成的終止,1. 兩種可能的誘導機制誘導物→刺激影響初級代謝，造成代謝流的改變→大量生成次級

62、代謝物誘導物→次級代謝物合成酶的合成→大量生產次生代謝物2. 實例色氨酸對麥角堿的作用甲硫(蛋)氨酸能提高頭孢霉素C的產量的誘導劑3. 大多數(shù)分解代謝酶屬于誘導酶，可以通過加入誘導物使酶的產量提高。,3.1 次級代謝產物的誘導調節(jié),The A-factor regulatory cascade of Streptomyces griseus,A-factor is detectable in the culture mediu

63、m just before the onset of streptomycin production.The signal(s) (?) that trigger its synthesis, mediated in some manner by AfsA, are not known.,1. 涉及對終產物阻遏實例1：20世紀40年代初期發(fā)現(xiàn)，青霉素發(fā)酵過程中，雖然葡萄糖被菌體利用最快，但葡萄糖不利于青霉素合成，而乳糖雖利用緩慢，但

64、能提高青霉素產量。實例2：頭孢霉素C的生物合成中，抗生素比產率遞減順序為：蔗糖>半乳糖>果糖>麥芽糖>葡萄糖，其中蔗糖是葡萄糖的兩倍多。不同的碳源對次級代謝產物積累的作用是不一樣的，一般認為速效碳源都比較差。,3.2 次級代謝產物碳源分解調節(jié),,2. 抗生素受碳源分解調節(jié)的可能機制(1) 可能與菌體生長速率控制抗生素合成有關。菌體生長最好的碳源能抑制抗生素合成，因此，在低生長率的情況下(例如青霉素合成中

65、緩慢補加葡萄糖)可減少葡萄糖的干擾作用。(2) 可能與分解代謝產物的堆積濃度有關。乳糖之所以比葡萄糖優(yōu)越，是因為前者被水解為可利用單糖的速度正好符合青霉素在生產期合成抗生素的需要，而不會有分解代謝產物如丙酮酸的堆積。,1.定義：氮源分解調節(jié)主要指含氮底物的酶(如蛋白酶、硝酸還原酶、酰胺酶、組氨酸酶和脲酶)的合成受快速利用的氮源，尤其是氨的阻遏。,3.3 次級代謝產物氮源分解調節(jié),(1）pH值＋質子梯度 改變能量代謝 細胞壁物質

66、和 結構的功能；(2)谷氨酰合成酶和丙氨脫氫酶的合成；(3)高度磷酸化的核苷，如ppGpp和pppGpp可能通過級聯(lián)機制調節(jié)次級代謝，而ppGpp等受氨基酸過量的負控制調節(jié)。,2. 氮源分解調節(jié)的可能機制：,已發(fā)現(xiàn)過量磷酸鹽對四環(huán)素、氨基糖苷類和多烯大環(huán)內酯類等32種抗生素的生物合成產生阻抑作用。所以，在工業(yè)生產中，磷酸鹽常常被控制在適合菌體生長的濃度以下，即所謂的亞適量。,3.4 磷酸鹽調節(jié),磷酸鹽是一些次級代謝的限制因素，高

67、濃度磷酸鹽表現(xiàn)出較強的抑制作用。,,磷酸鹽濃度高低還能調節(jié)發(fā)酵合成期出現(xiàn)的早晚，磷酸鹽接近耗盡后，才開始進入合成期。磷酸鹽起始濃度高，耗盡時間長，合成期就向后拖延。例：金霉素、萬古霉素等的發(fā)酵都有此現(xiàn)象。磷酸鹽還能使處于非生長狀態(tài)的、產抗生素的菌體逆轉成生長狀態(tài)的、不產抗生素的菌體。,磷酸鹽調節(jié)抗生素的生物合成的機制按效應來說，有直接作用和間接效應；磷酸鹽影響抗生素生物合成中的磷酸酯酶和前體形成中某種酶的活性（直接作用）；磷酸鹽

68、調節(jié)胞內其它效應劑（如ATP、腺苷酸能量負荷和cAMP），進而影響抗生素合成（間接作用）,3.5 次級代謝過程的啟動的原因,可能是生長期末細胞的酶的組成發(fā)生變化，與次級代謝物合成有關的酶的突然出現(xiàn)有關；也可能是前體的積累，起誘導物的作用或編碼次級代謝產物的基因從分解代謝物阻遏中解除阻遏所致。,啟動抗生素的幾種調控機制,盡管抗生素具有非常重要的社會和經濟重要性，但并不存在一個能夠解釋它們生理調節(jié)的通用的控制模型。此類調節(jié)往往發(fā)生在轉