豬腸球菌病病原分離鑒定及其分子致病機(jī)制研究.pdf

1、腸球菌為球形或卵圓形、呈鏈狀排列的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌。自從1984年從鏈球菌屬中分離出來(lái)單獨(dú)成屬以來(lái)，其成員已由原來(lái)的2個(gè)種增加到41個(gè)種。腸球菌不但可引起住院病人的腹膜炎、心內(nèi)膜炎、尿道炎和腦膜炎等，也可引起豬、羊、雞和鴨等動(dòng)物的感染。感染動(dòng)物的腸球菌可直接傳染給人，而食品中污染的腸球菌可導(dǎo)致人的食物中毒，因此腸球菌在公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要的意義。2003～2008年期間，我們?cè)诤幽鲜≡S昌、南陽(yáng)、鄭州、洛陽(yáng)等地送檢的病死豬分離出43株疑似腸球

2、菌的病原性細(xì)菌，該些細(xì)菌主要引起患豬敗血癥、腦膜炎和關(guān)節(jié)炎。對(duì)其進(jìn)行了常規(guī)的形態(tài)學(xué)觀察、耐受性試驗(yàn)、Vitek-32生化鑒定和全細(xì)胞蛋白型分析，并做了16SrRNA和RAPD等分子水平的研究。在此基礎(chǔ)上，調(diào)查了各分離株的毒力基因攜帶情況，并建立了小鼠腹膜炎模型，進(jìn)一步比較了毒力基因、毒力表型和抗生素抗性與分離菌的致病性關(guān)系，以期為研究細(xì)菌致病機(jī)制、豬感染的流行病學(xué)以至最終的預(yù)防和控制提供參考依據(jù)。
　　 細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果表明，所有

3、的分離菌均呈G+，卵圓形或球形，并呈長(zhǎng)短不一的鏈狀排列，能夠在6.5％NaCl肉湯、pH9.6葡萄糖肉湯和10℃、45℃和60℃30min條件下生長(zhǎng)。Vitek-32全白動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)僅成功鑒定出了43個(gè)分離株中的35株，分別為糞腸球菌(E.faecalis)11株、屎腸球菌（E.faecium）2株、鉛黃腸球菌（E.casseliflavus）22株，另有8個(gè)分離菌株未能鑒定到種的水平。細(xì)菌全細(xì)胞蛋白型分析結(jié)果與Vitek-32有明顯

4、不同，43株分離菌全細(xì)胞蛋白條帶的分子量差異主要在97KDa、90KDa、67KDa和46KDa處，其中具有蛋白分子量90KDa條帶的菌株有13個(gè)，與參考菌株ATCC29212和ATCC33186相似；而其余的菌株均具有46KDa、67KDa和97KDa3個(gè)條帶，故認(rèn)為它們是另外一種不同于糞腸球菌的腸球菌種類(lèi)。
　　 16SrRNA基因序列分析結(jié)果表明，43株腸球菌的16SrRNA序列與GenBank中登錄的各種腸球菌同源性均較

5、高。經(jīng)利用DNAStar軟件將感染豬的疑似腸球菌分離株與GenBank中32種腸球菌的16SrRNA序列進(jìn)行序列同源性分析，所有43個(gè)分離株均被鑒定到種的水平，其中13株與GenBank中登錄的4株糞腸球菌(Efaecalis)模式菌株AF515223、AJ301831、EU728747、NC_004668的同源性在99.3％～99.9％之間；而另30個(gè)分離株除HE25之外均與GenBank中登錄的3株屎腸球菌（Efaecium）模式菌

6、株EU547780、DO411813、Y18294的同源性在99.3％～100％之間；HN-25與其余29個(gè)屎腸球菌菌株的同源性在99％～99.4％之間。所測(cè)定的42株腸球菌(HN-N1～HN-N42)16SrRNA序列已被GenBank收錄，其登錄序列號(hào)依次為FJ378656～FJ378697。
　　 合成了19條隨機(jī)引物對(duì)腸球菌基因組DNA多態(tài)性進(jìn)行分析，以從基因組水平上進(jìn)一步驗(yàn)證鑒定的正確性，并通過(guò)分析各菌株親緣關(guān)系為腸球

7、菌的流行病學(xué)積累資料。結(jié)果顯示4條引物對(duì)所有菌株均擴(kuò)增出了多態(tài)性較好的條帶，通過(guò)SPSS11.5軟件計(jì)算其相似性系數(shù)，發(fā)現(xiàn)HN-3和HN-6菌株間遺傳距離指數(shù)為0.000，可能為同源菌株，其他菌株親緣關(guān)系則較遠(yuǎn)。在聚類(lèi)分析中，聚類(lèi)重新標(biāo)定距離(rescaled distance cluster combine)為21時(shí)，具有鑒定腸球菌至種水平的能力，試驗(yàn)的腸球菌菌株聚類(lèi)成4大類(lèi)群，分別為類(lèi)腸球菌聚類(lèi)群、屎腸球菌聚類(lèi)群、鳥(niǎo)腸球菌聚類(lèi)群和僅

8、有HN-25菌株聚類(lèi)群。在類(lèi)腸球菌聚類(lèi)分析中，聚類(lèi)重新標(biāo)定距離為19時(shí)，可將試驗(yàn)的類(lèi)腸球菌分成4個(gè)聚類(lèi)群；而屎腸球菌在聚類(lèi)重新標(biāo)定距離為19時(shí)，則分成2個(gè)聚類(lèi)群，除HN-25菌株為一聚類(lèi)群外，其他屎腸球菌形成一個(gè)大的聚類(lèi)群。
　　 為了研究腸球菌致病機(jī)制，通過(guò)調(diào)查豬臨床菌株、肉品菌株和豬糞便菌株12種毒力基因攜帶情況，發(fā)現(xiàn)糞腸球菌較屎腸球菌攜帶更多的毒力基因(7.83：3.73)；而3種來(lái)源的腸球菌中以臨床菌株毒力基因最多，其次

9、是肉品菌株，糞便菌株攜帶毒力基因最少。臨床糞腸球菌分離株中毒力基因gelE、efaA和sprE的檢出率為100％，ace、cylA和esp的檢出率分別達(dá)到84.6％、84.6％和69.2％，均明顯高于其他來(lái)源的菌株；而在臨床屎腸球菌菌株中，cylA和gelE的檢出率分別為83.3％和66.7％，也明顯比其他來(lái)源的高。
　　 在小鼠腹膜炎模型中，糞腸球菌均比屎腸球菌致病性強(qiáng)，而在試驗(yàn)的糞腸球菌中，各菌株的致病性也不相同，其中，以H

10、N-41的致病性最強(qiáng)，其LD50為106.01/ml，而HN-1致病性最弱，其LD50為107.01。屎腸球菌HN-32也較HN-15的LD50高。通過(guò)分析各菌株的毒力基因、毒力表型和抗生素抗性與致病性關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，致病性的大小與毒力基因攜帶多少成正相關(guān)，gelE、cylA、ace和esp等毒力基因?qū)χ虏⌒杂绊戄^大；毒力表型與致病性大小關(guān)系與腸球菌種有關(guān)，同種腸球菌中，β溶血性表型比明膠溶解表型與致病性大小更密切；腸球菌耐藥種類(lèi)多少與其致