人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因rnai表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定

1、<p>　　人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定</p><p>　　作者：毛立軍，鄭駿年，李望，鄭宏祥，劉俊杰，孫曉青，陳家存，溫儒民 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 重組質(zhì)粒 </p><p>　　摘要 :目的 構(gòu)建端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因的RNA干擾（RNAi）表達(dá)載體。 方法 化學(xué)合成能編碼針對(duì)hTERT基因的短發(fā)夾R

2、NA（shRNA）序列的寡核苷酸，退火處理后克隆到pSilencer1.0-U6shRNA表達(dá)載體的U6RNA聚合酶Ⅲ（PolⅢ）啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建重組RNAi質(zhì)粒pSliencer-hTERT。 結(jié)果 經(jīng)酶切電泳及測(cè)序分析證實(shí)，目的序列成功插入到預(yù)計(jì)位點(diǎn)。 結(jié)論 已成功構(gòu)建pSliencer-hTERT載體，為進(jìn)一步研究其對(duì)端粒酶活性的抑制作用打下基礎(chǔ)。 </p><p>　　關(guān)鍵詞 :RNA干擾;短發(fā)夾R

3、NA;人端粒酶轉(zhuǎn)錄酶;重組質(zhì)粒; </p><p>　　Abstract:Objective To construct the expressing vector of small hairpin RNA（shRNA）targeting human telomerase re-verse transcriptase（hTERT）gene.Methods Two template DNA oligonucleoti

4、des for shRNA expression targeted hTERT gene were chemically synthesized.The annealed shRNA templates were processed to produce and identify the recombinant RNAi plas-mid sPilencer-hTERT.Results It was demonstrated that

5、shRNA template targeting hTERT gene had been inserted at the ex-pected site and the insertion sequen</p><p>　　Key words:RNA interference;small hairpin RNAs;human telomerase reverse transcriptase;recombinant

6、plasmid </p><p>　　端粒酶的活化與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，通過激活端粒酶，端粒DNA得以延長(zhǎng)使細(xì)胞永生。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）是催化這一反應(yīng)的惟一限速酶，因此有希望成為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。RNA干擾是近年迅速發(fā)展起來的一項(xiàng)新的基因阻斷技術(shù)，能特異、高效地阻抑靶基因表達(dá)，有望成為腫瘤基因治療的有力工具［1］。本實(shí)驗(yàn)將針對(duì)hTERT mRNA的小干擾RNA（siRNA）模板插入siRNA

7、表達(dá)載體，構(gòu)建載體hTERT-siRNA表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究其對(duì)端粒酶活性的抑制作用打下基礎(chǔ)。 </p><p><b>　　1 材料和方法 </b></p><p>　　1.1 主要試劑 pSilencer1.0-U6質(zhì)粒為美國(guó)Am-bion公司產(chǎn)品，大腸桿菌JM109由徐州醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室保存。T4DNA連接酶以及小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Promega公司，

8、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ 和HindⅢ購自MBI公司。 </p><p><b>　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法 </b></p><p>　　1.2.1 模板DNA合成 選擇2段hTERT mRNA的序列作為RNA干擾的靶序列，序列一針對(duì)的是hTERT基因顯性失活突變體區(qū)（NM003219:堿基序列位置2182-2200）。序列二采用Ambin公司的網(wǎng)上設(shè)計(jì)軟件（www.am

9、bion.com）進(jìn)行設(shè)計(jì)，所對(duì)應(yīng)的的靶序列為hTERT（NM003219:747-765）。設(shè)計(jì)2對(duì)編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈。序列一:P1:5′-CAAGGTGGATGTGACGGGCTTCAAGAGAGCCC-GTCACATCCACCTTGTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAA-AAAAGCCCGTCACATCCACCTTGTCTCTTGAACAAG-GTGGATGTGACGGGCGGCC-3′。序列二:P1:5′-G

10、TCTGCCGTTGCCCAAGAGTTCAAGAGACTCTTGGG-CAACGGCAGACTTTTTT-3′，P2:5′-AATTAAAAA-AGTCTGCCGTTGCCCAAGAGTCTCTTGAACTCTTGG-GCAACGGCAGACGGCC-3′。其順序?yàn)锳paⅠ酶切位點(diǎn)、19nt正義序列、9nt loop接頭</p><p>　　1.2.2 質(zhì)粒pSilencer-hTERT表達(dá)載體的構(gòu)建 <

11、/p><p>　　1.2.2.1 寡核苷酸的退火 將合成的模板寡核苷酸溶解在100μl無核酶水中，取1μl用TE（10mmol.LTris，1mmol.L EDTA）稀釋，使終濃度為1g.L。取正義模板鏈、反義模板鏈各2μl加入46μl的退火緩沖液，在90℃孵育3min，37℃孵育1h。退火后形成的雙鏈用3%凝膠電泳，以10倍稀釋的合成的單正鏈為對(duì)照，檢測(cè)退火前后電泳圖譜是否有變化。 </p><

12、p>　　1.2.2.2 寡核苷酸與pSilencer1.0-U6連接 將針對(duì)不同hTERT序列的2對(duì)退火后的模板鏈與pSi-lencer1.0-U6線性表達(dá)載體連接，重組后的載體命名為pSilencer-hTERT1、pSilencer-hTERT2。按下列操作進(jìn)行:取5μl退火后的模板鏈用45μl無核酶水稀釋成終濃度8mg.L，建立10μl反應(yīng)體系:1μl上述稀釋退火模板鏈、6μl無核酶水、1μl10×T4DNA連接酶

13、緩沖液、1μl pSilencer1.0-U6、1μl T4DNA連接酶（5U.μl）。16℃孵育過夜。將重組載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞JM109后提取質(zhì)粒。 </p><p>　　1.2.3 陽性克隆鑒定 </p><p>　　1.2.3.1 酶切鑒定 用BamHⅠ或HindⅢ單酶切重組質(zhì)粒，所有各管于37℃水浴過夜。取7μl樣品在1%瓊脂糖凝膠和TAE緩沖液中80V電泳0.5h觀察結(jié)果。陽性克

14、隆應(yīng)該不能夠被HindⅢ單酶切，但可被BamHⅠ切出大約370bp的小條帶。 </p><p>　　1.2.3.2 測(cè)序鑒定 將BamHⅠ和HindⅢ酶切后電泳出現(xiàn)大約370bp的陽性重組質(zhì)粒送到上海英俊生物工程有限公司測(cè)序。 </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 退火寡核苷酸與單鏈寡核苷酸電泳結(jié)果 從

15、電泳圖（圖1）可見，退火前后寡核苷酸電泳圖譜明顯不同。Lane1條帶位置在100bp之前，約60bp左右。Lane2電泳圖譜出現(xiàn)3條帶，前面的2條與Lane4的2條帶相似，前面的應(yīng)該是單鏈寡核苷酸，后面的可能是2條單鏈的自身的連接，另一條帶在100bp位置上，可能是單鏈自身折疊形成了發(fā)夾結(jié) 構(gòu)，雖然分子量縮小，但由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)這種構(gòu)象的改變，導(dǎo)致了電泳遷移速率放慢。Lane3與Lane1相似，而Lane4出現(xiàn)2條帶，前面的應(yīng)該是單鏈寡核苷

16、酸，后面的可能是2條單鏈的自身的連接。從電泳圖可見序列一的單鏈自身折疊以及2條單鏈的自身的連接程度比序列一明顯得多。 </p><p>　　圖1 退火寡核苷酸與單鏈寡核酸電泳圖（略） </p><p>　　1、2分別是序列一退火后、單鏈核苷酸;3、4分別是序列二退火后、單鏈核苷酸;M為marker </p><p>　　2.2 重組質(zhì)粒酶切結(jié)果 將菌落擴(kuò)增后提取

17、質(zhì)粒，酶切鑒定結(jié)果顯示:2條序列構(gòu)成的重組質(zhì)粒都不能被HindⅢ單酶切，但可被BamHⅠ切出大約350bp大小的片段（圖2）。 </p><p>　　圖2 重組質(zhì)粒酶切電泳圖（略） </p><p>　　1、2分別是序列一、二的重組質(zhì)粒;3、4分別為HindⅢ酶切后重組質(zhì)粒;5、6分別為BamHⅠ酶切后重組質(zhì)粒 </p><p>　　2.3 測(cè)序結(jié)果 由序列一構(gòu)

18、成的重組的陽性RNAi載體反復(fù)測(cè)序時(shí)信號(hào)都無法通過造成測(cè)序失敗，由序列二構(gòu)成的重組的陽性RNAi載體測(cè)序的結(jié)果，與我們?cè)O(shè)計(jì)合成的靶向hTERT的正義鏈完全一致，說明本實(shí)驗(yàn)已把合成的寡核苷酸插入到了RNAi載體pSilencer1.0-U6siRNA中，成功構(gòu)建了能靶向端粒酶hTERT基因的pSilencer1.0-U6siRNA載體。 </p><p><b>　　3 討論 </b><

19、;/p><p>　　RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由于與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默過程，該技術(shù)已成為生物學(xué)研究進(jìn)展最快的領(lǐng)域之一。最初是利用化學(xué)合成的siRNA實(shí)現(xiàn)RNAi，但siRNA作用時(shí)間短暫，進(jìn)入細(xì)胞后很快被降解，24h后阻抑效果降低，作用持續(xù)時(shí)間約48h。為克服此缺陷，人們?cè)O(shè)想出利用載體介導(dǎo)siRNA體內(nèi)表達(dá)技術(shù)，其原理是將siRNA對(duì)

20、應(yīng)的DNA模板插入載體中位于RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子下游，在RNA聚合酶Ⅲ作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的siRNA（shRNA）［2］ 。據(jù)此，Brummelkamp［3］ 設(shè)計(jì)出針對(duì)靶基因的siRNAs的模板DNA，將其與質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，結(jié)果DNA模板在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成的shRNA具有與siRNA同樣的抑制靶基因表達(dá)作用，更為重要的是這種作用可持續(xù)2個(gè)月。 </p><p>　　siRNA序列的選擇常遵循如下規(guī)則:

21、其長(zhǎng)度通常為19～21個(gè)堿基，一般從基因編碼序列或cDNA序列的起始密碼開始，向下游尋找腺苷二核苷酸（AA），標(biāo)記并選擇每個(gè)AA及其下游鄰近的19個(gè)核苷酸序列一起作為siRNA的靶序列。在設(shè)計(jì)siR-NA的過程中，要避開cDNA的5′和3′非編碼區(qū)（un-translated regions，UTRs）以及5′起始密碼區(qū)附近50～100個(gè)核苷酸的序列，因?yàn)樵谶@些區(qū)域含有豐富的蛋白結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合的調(diào)節(jié)蛋白以及形成的翻譯起始復(fù)合物等可以影響

22、siRNA與dsRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA induced silencing complex，RISC）結(jié)合到靶mRNA上［4］ 。所選擇的siRNA序列必須進(jìn)行全基因組掃描（BLAST）和序列同源分析。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的siRNA模板序列順序?yàn)?正義鏈 （19nt）―loop環(huán)區(qū)（TTCAAGAGA）―反義鏈（19nt）―RNA聚合酶Ⅲ終止子（TTTTTT）。所用載體為:當(dāng)其插入pSil

23、encer1.0-U6線性化質(zhì)粒U6啟動(dòng)子下游后，在RNA聚合酶Ⅲ作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生含發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)的siRNA，當(dāng)轉(zhuǎn)錄至模板上的一連串T時(shí)轉(zhuǎn)錄終止。 </p><p>　　本實(shí)驗(yàn)選擇的序列二經(jīng)酶切、測(cè)序鑒定證實(shí)成功構(gòu)建了hTERT siRNA表達(dá)質(zhì)粒pSliencer-hTERT。采用的序列一曾被Kosciolek等［5］ 作為靶序列化學(xué)合成siRNA，并且在腫瘤細(xì)胞中證明有效。本實(shí)驗(yàn)以此序列構(gòu)建載體，酶切證實(shí)siRN

24、A模板已插入載體，但在重組質(zhì)粒測(cè)序的過程中，反復(fù)出現(xiàn)沒有信號(hào)的現(xiàn)象，分析其原因可能是由于G.C含量過高，形成二級(jí)結(jié)構(gòu)使測(cè)序信號(hào)無法通過造成的。在序列設(shè)計(jì)的過程中還要注意盡量避免G.C含量較高的序列，最好選擇在40%～45%，G.C含量超過55%時(shí)的siRNA誘導(dǎo)的RNAi的效果較差。 </p><p><b>　　參考文獻(xiàn) : </b></p><p>　　［1］

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